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设计性实验-多糖的定性与定量
设计性实验-多糖的定性与定量 第一部分 多糖的鉴定,纯化与含量测定-----蒽酮比色法 一、目的: 掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。 二、原理: 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后,与蒽酮(C14H10O)脱水缩合,形成糠醛的衍生物,呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收,在150 μg/ml范围内,其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。 这一方法有很高的灵敏度,糖含量在30 μg左右就能进行测定,所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下,采用这一方法比较合适。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器:电热恒温水浴锅,分光光度计,电子天平,容量瓶,刻度吸管等 2.试剂: (1)葡萄糖标准液:l00 μg/ml (2)浓硫酸 (3)蒽酮试剂:0.2 g蒽酮溶于100 ml浓 H2SO4中。当日配制使用。 四、操作步骤 1.葡萄糖标准曲线的制作 取7支大试管,按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液: 管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液(ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水(ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量(μg) 10 20 30 40 60 80 在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1,迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加盖,以防蒸发。自水浴重新煮沸起,准确煮沸l0 min取出,用冰浴冷却至室温,在620 nm波长下以第一管为空白,迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量(μg)2.1.1 Savage法将多糖粗品稀释成1.5%的水溶液400mL,加人100 mL氯仿/丁醇混合液(体积比4,1),充分振荡使蛋白质析出,以2 000 r/min离心30 min,除去沉淀,将上清液再用此方法处理,重复7次.最后得到脱去蛋白的上清液.将该上清液逆向流水透析3d,将其减压浓缩至200 mL左右,加人2倍体积无水乙醇,充分搅拌,放置过夜,使普鲁兰多糖沉淀,沉淀液以4 500 r/min离心30 min,将沉淀用丙酮、乙醚依次洗涤,P205干燥 2.1.2 DEAE一纤维素柱层析将经Savage法除蛋白的多糖粉末溶于10m L蒸馏水 中,进行DEAE一纤维素(硼酸型)柱层析(3.3 cm X 40 cm),洗脱速度为1 mL/min.首先用蒸馏水洗脱,分部收集(每管5 mL),用改良的苯酚一硫酸法比色鉴定多糖部分,收集多糖峰,减压浓缩、透析、冷冻干燥得4.2g样品1.该层析柱用0.12 m ol/L硼砂洗脱,洗脱曲线如图2所示.同样收集多糖峰,浓缩、透析、冷冻干燥得1.5 g 样品 2.1.3 SephadexG -100柱层析分别取样品进行SephadexG -100柱层析(1C MX 100c m),进样量为0.5 m L,样品质量分数为0.70 o,用蒸馏水进行洗脱,洗脱速度 为4 mL/h,用改良的苯酚一硫酸法比色鉴定多糖部分,各有一个洗脱峰,收集洗脱峰后分别冷冻干燥得白色粉末 3.判别 参照步骤1,用显色反应判断样品是否为多糖。 4.测定 吸取1 ml已稀释的提取液于试管中,加入4.O ml蒽酮试剂,平行三份;空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量(μg))───────────── × 100 W × V测 × 106 其中:C——在标准曲线上查出的糖含量(μg)总体积(ml)测定时取用体积(ml)D——稀释倍数W——样品重量(g)106——样品重量单位由g换算成μg的倍数 第二部分 多糖组分的检测-----TLC分析法 1 材料与方法 1.1 药品与材料 多糖;D.葡萄糖、D.半乳糖,D.木糖、L.鼠李糖、D.果糖上海试剂二厂;盐酸、乙酸乙脂、口}匕啶、无水乙醇、正丁醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、醋酸、磷酸、硫酸、苯胺、二苯胺皆为分析纯试剂;实验用水为蒸馏水。 微量定量点样毛细管美国科尔帕默公司;20cm×20cm 硅胶层析板德国默克公司。 1.2 单糖和混合单糖标准溶液的配置 分别称取果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖,分别溶于蒸馏水中制得五种单糖标准液。浓度均为1.00m/m1。 分别称取葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、鼠李糖,共溶于2m1蒸馏水制得混合单糖标准液。各单糖在混合单糖标准液中的浓度为O.50mg/ml。 1.3 水解多糖样品的制备 多糖样品液加入12mol/L的HCI O.25ml,置于高压釜中在120~126℃条件下水解4h。中和、透析后稀释至10ml。 1.4 展开系统配置 展开系统1:分别把乙酸乙脂、吡啶
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