甲醛法测量蛋白粉蛋白质含量原理解析.docVIP

甲醛法测量蛋白粉蛋白含量原理解析 牛司锋，山东公司品管部 玉米蛋白粉又叫黄粉，是在加工玉米时提取出的不溶性蛋白质。检测其蛋白含量的原理是有机物在浓硫酸和过氧化氢的作用下，加热分解氧化生成铵态氮（NH4+），在中性条件下与甲醛反应生成硫酸和环六次甲基四胺的共轭酸（(CH2)6N4H+），以酚酞为指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定，根据氢氧化钠溶液消耗的体积求出蛋白粉蛋白含量。 实验步骤及相关原理： 1. 蛋白硝化（第一遍） 准确称取混匀样品0.2g（精确至0.0001g）至150mL锥形瓶中，润湿，加入2.5mL浓硫酸、10mL过氧化氢，在电炉上硝化，当烟至瓶口时取下。 其中过氧化氢是催化剂，浓硫酸既表现脱水性（把氨基酸中的氨基以氨气的形式脱去）又表现酸性（脱去的氨与硫酸反应生成(NH4)2SO4）。方程式为： 2R-CH2-CH(-NH2)-COOH＋(浓)H2SO4==2R-CH=CH-COOH＋(NH4)2SO4……………（1） 在第一遍硝化时之所以变黑或发黄就是因为过氧化氢没有了，主反应没有催化剂进行极其迟缓，甚至停滞，浓硫酸在此时把有机物碳化，生成了碳单质，才有了变黑的副反应。 拿下锥形瓶冷却，此过程中有黑色变浅或消失现象，是因为随温度的逐渐降低产生了新的副反应，方程式为： C＋（浓）2H2SO4==CO2↑＋2SO2↑＋2H2O………………………………………………（2） 2. 蛋白硝化（第二遍） 待称量瓶冷却至室温后，再加5ml过氧化氢继续硝化，然后冷至室温。 在此过程中，一少部分过氧化氢与碳反应，方程式为： 2H2O2＋C==CO2＋2H2O…………………………………………………………………（3） 而大部分过氧化氢则作为主反应（1）的催化剂，使（1）进行彻底。在第二遍硝化快结束时，锥形瓶中剩下的溶液主要是浓硫酸与硫酸铵的混合物，冒的白烟是三氧化硫，方程式为： H2SO4(338℃)==SO3↑＋H2O………………………………………………………………（4） 只要存在硫酸，体系的温度就不会超过338℃，而硫酸铵的分解温度为350℃。因此，只要瓶里受热处有一点溶液（硫酸），硫酸铵就不会受热分解而脱离体系。 3. 粗中和 加入蒸馏水50mL，并滴加0.1%甲基红指示剂2~3滴，用10 mol/L的氢氧化钠中和至淡黄色，再用4 mol/L的硫酸调至红色，并过量一滴，加3粒玻璃珠，放在电炉上煮沸一分钟，取下密塞冷却至室温。 硝化后锥形瓶内的主要物质是水、硫酸、硫酸铵，用10 mol/L氢氧化钠的目的是中和过量的硫酸，从而少消耗0.1 mol/L的氢氧化钠，用10 mol/L氢氧化钠滴定至淡黄色过程的反应方程式为： H2SO4＋2NaOH==2H2O＋Na2SO4…………………………………………………………（5） 氢氧化钠同时可以与硫酸铵反应，方程式为： 2NaOH＋(NH4)2SO4==Na2SO4＋2NH3·H2O………………………………………………（6） 在氨水生成的同时，过量的硫酸即与其反应生成硫酸铵，方程式为： H2SO4＋2NH3·H2O==(NH4)2SO4＋2H2O…………………………………………………（7） 也就是说，10 mol/L的氢氧化钠在与硫酸反应完后才会有（6）的反应，当甲基红变为黄色时即有（6）反应，此时有氨水生成，溶液受热或摇动或加过量氢氧化钠都有利于氨气的溢出，方程式为： NH3·H2O(△)==NH3↑＋H2O………………………………………………………………（8） 而用4 mol/L硫酸的目的是控制氮的流失。如果在粗中和时氢氧化钠过量且用力晃动，而且用4 mol/L硫酸返滴过于缓慢，即可能会导致氮的流失，致使最终结果偏低，所以粗中和应返滴迅速。 注：①要经常清洗存放10 mol/L氢氧化钠瓶的瓶口，防止生成的Na2CO3晶块混入溶液中，造成用硫酸返滴时甲基红不能返回红色；②在粗中和时要小心不要把氢氧化钠溶液滴在壁上，如果锥形瓶内壁上有残留，在煮沸时水蒸汽会把它冲下，由于酸的浓度很低，致使溶液显碱性而变色。 4. 细中和 用0.1 mol/L的氢氧化钠中和至淡黄色，加入1:1的中性甲醛10 mL，滴加1%的酚酞指示剂2~3滴，密塞静置10分钟。 粗中和后，加热煮沸目的是为了去除溶液中的CO2。细中和目的就是把粗中和时过量的硫酸中和掉，理论上达到中性溶液环境，中和完后加入中性甲醛并静置，而静置十分钟目的就是使（9）反应充分。此时是甲醛法检测蛋白的中心反应，方程式为： 4(NH4)2SO4＋12HCHO==（(CH2)6N4H）2SO4＋3H2SO4＋12H2O………………………（9） 5. 滴定 用0.1mol/L的氢氧化钠滴定至粉红色，并记录消耗氢氧化钠的体积。滴定的方程式为： （(CH2)6N4H