浅析淫羊藿苷对自发性高血压大鼠心室重构的调节.docVIP

浅析淫羊藿苷对自发性高血压大鼠心室重构的调节 　　心室重构作为心脏事件的独立危险因素，与心律失常、心力衰竭和猝死等有密切的关系，表现为心肌肥厚、心腔扩大、心脏的收缩和舒张功能障碍，是心脏疾病走向终末期的一个必然阶段。近年来研究表明，PPARalpha;、PPARgamma;的激活对心血管具有保护效应，且心室重构时PPARalpha;、PPARgamma;被抑制，导致心肌脂质和能量代谢紊乱，因此PPARalpha;、PPARgamma;在心室重构的过程中发挥着重要的作用。淫羊藿具有“补肾阳，祛风湿，益气力，强心力”等功效。淫羊藿苷(icariin，Ica)是淫羊藿的主要活性成分之一，具有降血压、抗肿瘤、增强免疫力、调节内分泌及抗骨质疏松等作用。本研究拟进一步确证Ica是否具有抗自发性高血压大鼠心室重构的作用，及该作用是否与PPARalpha;、PPARgamma;的表达变化有关。 　　1　材料与方法 　　1.1　动物 　　14周龄♂自发性高血压大鼠(SHR)，14周龄同源正常的京都大鼠(WKY)，SPF级，体质量260～300g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001。 　　1.2　试剂与仪器 　　淫羊藿苷(纯度ge; 98%)购于南京泽朗医药有限公司;RNA逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;PPARalpha;、PPARgamma;mRNA引物由宝生物工程(大连)有限公司合成;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所;PPARalpha;、PPARgamma;兔抗大鼠抗体购自美国Abcam公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购自江苏碧云天生物技术研究所;realtimeRTPCR扩增仪、imark酶标仪、电泳仪、TransBlot转移系统及CCD成像系统均系美国BIORAD公司产品;Leica光学显微镜为德国LeicaMicrosystemsLtd产品。 　　1.3　分组及给药 　　21只14周龄♂ SHR大鼠随机分为模型组、Ica低剂量组(20mg·kg-1)、Ica高剂量组(40mg·kg-1)，7只WKY大鼠为空白对照组。所有大鼠适应性喂养1周后，Ica低、高剂量组灌胃给药，每日2次，至26周龄，空白和模型组灌胃给予等体积双蒸水，实验结束后处死全部动物，取标本备用。 　　1.4　观察指标及检测 　　1.4.1　心肌中羟脯氨酸(Hyp)含量的检测　采用ELISA方法检测大鼠心肌羟脯氨酸含量。称取50～60mg心肌组织放入1mLPBS缓冲液中冰浴匀浆，离心后取上清，稀释标准品、加样、温浴、洗涤、加酶、洗涤、显色、测定。计算大鼠心肌中Hyp含量。胶原相对浓度(mg· g-1)=Hyp相对浓度times;__746。 　　1.4.2　形态学观察　取各组大鼠心脏组织，置于10%福尔马林固定48h后，经脱水、包埋、切片和Masson染色，Leica光学显微镜下观察心肌形态结构，并拍照记录。 　　1.4.3　心肌组织中PPARalpha;、PPARgamma;mRNA的表达　每组各取心脏标本5例，采用realtimeRTPCR法检测。PPARalpha;、PPARgamma;的mRNA引物序列由宝生物工程(大连)有限公司合成。目的基因表达相对定量法：以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需的循环数(cyclethreshold，Ct值)为统计参数，依次计算平均Ct值=(Ct1 + Ct2)/2(重复管);dCt=平均Ct值-中间值;基因的表达=2-dCt;相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达times;100，将空白对照组的mRNA表达量设定为101. 　　4.4　心肌组织中PPARalpha;、PPARgamma;蛋白的测定 　　Westernblot法测定心肌组织中PPARalpha;、PPARgamma;蛋白含量，每组大鼠取心脏组织，每个样本加入总蛋白裂解液，在冰块中操作匀浆，BCA法进行蛋白定量，用酶标仪在波长为560nm的条件下测得OD值，配成同体积同浓度后，加入上样缓冲液变性，加样进行分离胶和浓缩胶板中电泳，取胶放入转印槽中进行转印，取出转印膜，5% 脱脂奶粉封闭，TBST清洗，放入稀释好的一抗中，PPARalpha;(1∶1000)、PPARgamma;(1 ∶800)，4℃ 过夜。放入稀释后的二抗中(1∶3000)，加超敏ECL发光剂进行显色。采用QuantityOne定量分析软件系统对图像进行灰度值测定。 　　1.5　统计学处理 　　采用SPSS16.0软件进行统计分析，实验数据珋xplusmn;s表示，组