SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量.pptVIP

SDS测定蛋白质 相对分子质量 【目的要求】 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 【实验原理】 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 将已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 【操作方法】 １、垂直板电泳槽 1）分离胶的制备 配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul（两块胶的量？？？）。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取3.2~3.5ml凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内.再用注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。37℃烘箱下聚合（约30 -60min）。待凝胶完全聚合.将贮槽的蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。 2）浓缩胶的制备 配制3%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.12ml,浓缩胶缓冲液1.25ml,10%SDS 0.05ml,凝胶储备液0.6ml，10% 过硫酸铵 25ul和TEMED 5ul（两块胶的量？？？）。混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。 轻轻插入梳齿至浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合。 3、蛋白质样品的处理 1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400  牛血清白蛋白 MW=66,200  牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为110V，电泳80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。 7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR： 相对迁移率mR= 【思考题】 1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作用分别是什么？ 2、在SDS中,分离胶中的TEMED和AP的作用是什么? 3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟? * * CH2=CH C=O NH2 丙烯酰胺 N, N’-甲叉 双丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH 聚丙烯酰胺 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CH CH2ˉ CH C=O NH2 CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH CH2-CH C=O NH2 CH2-CH CH2-CH ( )n ( )n ( )m ( )m PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而