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巢式PCR 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异 。 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 　　巢式PCR，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的PCR。 Touchdown PCR 用来避免非特异性序列的扩增 PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。 递减PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。 * * 鉴定基因 亲子鉴定 诊断遗传病 克隆基因 诱变 分析远古DNA 鉴定特定表型的突变体基因 比较基因表达量 PCR的应用 * * 参考文献： 1 吴晓梅.人工杂交法获得拟南芥酯酶基因位点AT1G54790/AT2G429双 突变体及其PCR鉴定与表型分析[J]2010.49(6):1285-1288 2 陈阳婷.三重RT-PCR快速检测多种马铃薯病毒的研究[J]2010.6:75-77 徐君怡 曹际娟 于珂 徐杨.PCR方法特异性鉴定狮源性制品[J]2010.7:44-46 袁继红.实时荧光定量PCR技术的实验研究[J]2010.13:20-22 徐君怡 曹际娟 王秋艳 王长文.SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测鉴定狮制品[J]2010.31(4):171-174 雷群英.PCR 技术的种类及其应用[J]1998.29(4):44-47 * * 杨坤，优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究[J] 2010.10：5002-5005 8 王静，反向PCR分离侧翼序列技术研究进展[J]2010.3：200-202 马沁沁，水稻花药绒毡层特异表达启动子的分离与表达载体构建[J]2010.11（4）：200-205 10 张于勤，多对型特异性引物巢式PCR检测乙型肝炎病毒基因型分析[J]2010.7（13）：1306-1308 谢谢 优秀精品课件文档资料 PCR的种类及应用 学号 王志慧 序 * * PCR的历史 操作过程 引物 步骤 PCR的各种变体 PCR的应用 鉴定基因 亲子鉴定 诊断遗传病 克隆基因 诱变 分析远古DNA 鉴定特定表型的突变体基因 比较基因表达量 目录 * * PCR这项技术是由凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。 PCR 历史 * DNA的复制 DNA在复制时，双链DNA解旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链(leading strand)；另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(lagging strand)。 * * ①5’→3’的聚合作用：不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 ②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。 ③