分析慢病毒介导的干扰ＣｌＣ-３肝癌的改变　.docVIP

分析慢病毒介导的干扰ＣｌＣ-３肝癌的改变　 　　电压门控性氯通道3(voltage-gatedchloridechannel3，ClC-3)是ClC家族成员之一，广泛分布于脑、肾、肝、骨骼肌、心脏和胰腺等组织器官，主要定位在细胞膜和细胞质内的囊泡膜，生理功能目前尚未完全清楚，可能通过容积激活性氯电流参与细胞容积的调节，从而参与细胞增殖、分化、凋亡和迁移等过程。ClC-3在某些疾病的发生发展中也有重要作用，可能通过调控心肌细胞容积及活性氯电流参与心肌肥大的形成，高表达可能参与了肺动脉高压和肺动脉炎症的机体适应性反应，其缺失可能是脑海马神经元退化的病因。研究发现，在宫颈癌、肺癌、乳腺癌、膀胱移行细胞癌和人胶质瘤组织中ClC-3高表达，采用氯通道阻断剂可有效抑制乳腺癌细胞的增殖，应用ClC-3反义寡核苷酸可增强其抑制效果。这些都提示ClC-3与肿瘤的关系非常密切，可能会在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。转移是大多数肿瘤患者死亡的原因，ClC-3是否参与肿瘤转移过程更加值得研究和探讨。本研究利用慢病毒介导的shRNA技术，转导人高转移肝癌细胞株MHCC97H，建立稳定干扰ClC-3基因的细胞株，并进一步观察其体外侵袭和迁移能力的改变，为进一步研究ClC-3在肿瘤发生发展中的作用，以及以ClC-3为靶点的肿瘤治疗的可行性奠定基础。 　　1　材料与方法 　　1.1　材料 　　高转移人肝癌细胞MHCC97H、人胚肾细胞293FT、大肠杆菌stb13、慢病毒包装系统PL-LU2G、pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4 和pLV/helper-SL5由本实验室保存，胎牛血清和RPMI1640培养基购自Gibco公司，XhoⅠ、HpaⅠ内切酶和T4DNA连接酶购自NEB公司，质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司，转染试剂Lipofectamine2000和总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒ReverTraAceqPCRRTMasterMix和荧光定量PCR试剂盒SYBRGreenRealtimePCRMasterMix购自广州美津生物技术有限公司，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG均购自碧云天生物技术研究所，兔抗人ClC-3多克隆抗体购自Abcam公司，化学发光试剂购自Bio-Rad公司，Matrigel购自BD公司，Transwell小室购自Corning公司。 　　1.2　方法 　　1.2.1　干扰序列设计 　　在GenBank检索出人ClC-3基因核苷酸序列(基因号NM_001829)，设计针对人ClC-3的3个干扰RNA序列(Tab1)。正义与反义siRNA之间由6个碱基(CTCGAG)的loop环连接，上游链5prime;端加上一个T碱基，下游链5prime;端加上XhoI酶切粘端。同时设计1条无关序列作为阴性对照，作用序列为5prime;-GCTCTGGAGCAGTTCCGATAT-3prime;，通过BLAST验证该序列对任何基因无干扰效应。OligoDNA由上海英骏生物技术有限公司合成。 　　1.2.2　慢病毒表达载体的构建及鉴定 　　空载体PLLU2G含有增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorecenceprotein，EGFP)序列，用限制性内切酶XhoⅠ和HpaⅠ双酶切空载体，并回收酶切片段。上下游OligoDNA经退火形成双链DNA，然后与线性化后的空载体PLLU2G在T4DNA连接酶作用下16℃过夜连接，连接产物转化感受态细胞stb13。PCR鉴定阳性的菌落接种LB液体培养基中培养过夜，提取质粒送测序。经测序鉴定正确的重组质粒分别命名为PLLU2G-shClC-3-1、PLLU2G-shClC-3-2、PLLU2G-shClC-3-3、PLLU2G-shControl。 　　1.2.3　慢病毒包装 　　收集对数生长期的293FT细胞，接种5times;106 个于10cm的培养皿中，37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。按照说明书用脂质体进行共转染：将辅助质粒pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5和目的质粒各4mu;g与40mu;LLipofectamine2000用3mL的无血清Opti-MEM I培养液制备成DNA-脂质体复合物，滴加到293FT细胞中。分别收集转染后48h和72h的上清液，用045mu;m滤器进行过滤，滤液经超速离心后浓缩，分装，保存于-80℃。 　　1.2.4　病毒滴度测定 　　滴度测定采用逐孔稀释法，测定前1d