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pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究 　　应激蛋白Argonaute1是一种多功能蛋白，参与RNA干扰及应激颗粒(SGs)、加工体(PBs)形成等多种细胞生物学过程。pmCherry-C1是一种可以编码红色荧光蛋白的真核表达载体。2015年9～11月，本研究通过基因工程技术将Argonaute1基因片段连接至pmCherry-C1载体，构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒，旨在为深入研究Argonaute1蛋白的细胞生物学功能提供便利工具。 　　1材料与方法 　　1.1材料质粒、菌株及细胞:pmCherry-C1载体由JohanPerane博士馈赠，感受态大肠杆菌Trans1购自天津科仪嘉欣科技有限公司，HeLa细胞来自本实验室。酶类及主要生化试剂:限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA连接酶均购自ThermoFisherScientific公司，Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术公司，T/A载体(pEASY-T1)购自北京全式金生物技术有限公司，B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，质粒快速提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司，LumiGLo化学发光底物购于KPL公司。抗体:兔抗人Argonaute1单克隆抗体购自CST公司，鼠抗人G3BP单克隆抗体和兔抗人DCP1alpha;抗体购自abcam公司，鼠抗人樱桃红蛋白(Cherry)单克隆抗体购自MBL公司，蓝色荧光(AlexaFluor350)标记的驴抗鼠荧光二抗和绿色荧光(AlexaFluor488)标记的驴抗兔荧光二抗购自Invitrogen公司，辣根过氧化物酶标记的抗鼠和抗兔IgG二抗购自KPL公司。引物合成及基因测序由北京天一辉远公司完成。 　　1.2pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒构建 　　1.2.1Argonaute1蛋白目的片段获取提取HeLa细胞的总RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列进行Argonaute1的cDNA扩增;根据CDS序列(NM012199.2)设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点的引物序列，即F:5#39;-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3#39;;R:5#39;-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3#39;;以反转录的Argonaute1cDNA为模板，扩增PCR目的片段，条件为95℃预变性5min，95℃30s、65℃45s、72℃3min，共15个循环，每次循环降低1℃，再以50℃进行20个循环，72℃延伸10min;将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，并将目的片段与pEASY-T1(T/A载体)于25℃连接15min。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞，置于含有氨苄/卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段。 　　1.2.2线性pmCherry-C1质粒载体获取以质粒快速小提试剂盒提取pmCherry-C1质粒，进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，完整切下呈线性的pmCherry-C1质粒载体，以1%琼脂糖电泳分离，再以凝胶回收试剂盒回收pmCherry-C1线性载体(约4700bp)。在T4DNA连接酶作用下，将线性pmCherry-C1质粒载体与具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22℃下连接并过夜。连接产物转化感受态细菌大肠杆菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取重组质粒。 　　1.3pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒鉴定 　　1.3.1酶切及基因测序采用EcoRⅠ和BamHⅠ对重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1进行单、双酶切鉴定，并以1%琼脂糖凝胶电泳验证片段大小;同时对重组质粒进行基因测序鉴定。 　　1.3.2融合蛋白检测采用Westernblotting法。以预冷的1times;NP-40裂解液裂解细胞，超声破碎细胞后4℃、12000r/min离心10min，取上清获取全细胞裂解液，以BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。裂解液中加入SDS上样缓冲液(pH6.8的50mmol/LTris-Cl、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、2.5%beta