GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞的调控效果.docVIP

GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞的调控效果 　　树突状细胞(DC)的功能关键取决于其所处的发育阶段。成熟的树突状细胞(mDC)可激活免疫应答，未成熟树突状细胞(iDC)则诱导免疫耐受。自身免疫性疾病患者体内DC易于成熟，大部分处于成熟状态，其过度提呈自身抗原导致自身耐受丧失和免疫调节功能紊乱。因此，研究DC成熟的分子机制、探索维持DC未成熟状态的新途径，通过诱导产生耐受型DC对机体进行免疫重建和恢复免疫平衡，成为自身免疫性疾病治疗的研究热点。 　　GSK-3beta;是一种广泛存在于真核细胞的多功能丝/苏氨酸蛋白激酶，在多种细胞功能活动的调节中扮演着重要的角色，与代谢、信号转导、细胞周期、基因表达、生长发育、肿瘤发生以及神经保护均密切相关。近年来，GSK-3beta;在免疫学领域的研究得到发展，其在固有免疫、获得性免疫应答中发挥着重要作用，因此成为受免疫学家瞩目的焦点蛋白。目前，GSK-3beta;对DC成熟和功能的影响并不明确。 　　本研究比较了iDC和mDC中GSK-3beta;的活性变化，初步证实GSK-3beta;是否参与DC成熟和功能的调控;利用小分子抑制剂抑制GSK-3beta;的活性，观察GSK-3beta;对DC成熟和功能的影响;进一步探究了GSK-3beta;对调控DC成熟的关键转录因子RelB表达的影响，为GSK-3beta;作为新靶点应用于耐受性DC的构建提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 　　6~8 周龄SPF 级纯系雄性C57BL/6 和BALB/c 小鼠，由南方医科大学实验动物研究所提供。 　　1.2 主要试剂 　　澳洲胎牛血清、RPMI 1640培养基和PBS(Gibco);rhGM-CSF和rhIL-4(Peprotech);脂多糖和SB216763(Sigma);CD11cMicroBeads(Miltenyibiotec);尼龙毛(Polysciences);红细胞裂解液(北京碧云天);封闭抗体CD16/32，大鼠抗小鼠FITC- CD11c、APC- CD40、PerCP-eFluor710-MHC-II 流式抗体及相应同型抗体(eBioscience);大鼠抗小鼠PE-CD86 流式抗体及其同型抗体(BD);CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所);丝裂霉素C(Roche);TriZol试剂、逆转录试剂盒和荧光定量PCR检测试剂盒(TaKaRa);兔抗鼠beta;- actin、GSK-3beta;及其Ser9 和Y216 磷酸化抗体(CST);兔抗鼠RelB抗体(SantaCruz);HRP-羊抗兔IgG二抗(北京博奥森)。 　　1.3 小鼠BMDC 的分离和培养 　　小鼠BMDC 的分离和培养的方法参考本实验室发表的文章。无菌取C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，裂解红细胞后，调整细胞浓度为1times;106/mL，以每孔4 mL接种于6 孔板，并加入终浓度为20 ng/mL 的rmGMCSF和10 ng/mL 的rmIL-4，37 ℃、5% CO2条件下培养。培养的第2天，经手法筛选弃去悬浮细胞，补充含相同浓度细胞因子的培养基;第4天半量换液，补足细胞因子;培养至第6天，收集半贴壁和悬浮的细胞，即为未成熟DC。台盼蓝染色鉴定活力，取活力较好的细胞经CD11c 免疫磁珠纯化，用于后续实验。 　　1.4 DC2.4细胞的培养 　　树突状细胞系DC2.4购自于上海蕾蒂生物科技发展公司。使用含10% FBS 的RPMI 1640 培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养。 　　1.5 SB216763处理未成熟DC和分组 　　收集纯化后的未成熟DC，铺于12孔板，每孔2times;106个细胞，培养体系为2 mL。加入10 mu;mol/L SB216763，或1 mu;g/mL 脂多糖，或加入10 mu;mol/L SB216763 20 min后加入1 mu;g/mL 脂多糖，或加等量DMSO作为阴性对照。继续培养24 h，进行表型、细胞因子和MLR检测。 　　1.6 流式细胞术检测DC表型 　　收集DC，用含2%FBS的PBS洗涤后调整浓度为5times;106 /mL，取100 mu;L加入1 mu;L CD16/32抗体封闭，冰上放置10 min。按说明书加入适量的流式抗体或相应同型抗体，4 ℃避光孵育20 min。离心洗去抗体，加入500 mu;L 的PBS 上流式细胞仪(FACSCalibur 流式细胞仪，BD公司)进行检测。 　　1.7 qRT-PCR检测细胞因子的表达 　　收集各组DC，采用T