IL-33 scFv-IgG1Fc全人源抗融合蛋白在CHO k1 细胞中稳定高表达.docVIP

IL-33 scFv-IgG1Fc全人源抗融合蛋白在CHO k1 细胞中稳定高表达 　　白细胞介素33( interleukin 33，IL-33) 是IL-1 家族成员，广泛表达于多种组织与细胞，主要参与调节Th2 细胞型免疫反应，与过敏性疾病、自身免疫性疾病有明显的相关性。用IL-33 抗体抑制IL-33 / ST2通路，可以减轻小鼠过敏性哮喘、过敏性鼻炎以及类风湿性关节炎症状，抑制病情发展，是过敏性及自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。单链抗体( single-chain antibody fragment，scFv)可通过全人源抗体文库筛选，本课题组将前期筛选的全人源抗IL-33 scFv与人源的IgG1 Fc 段融合构建了通用真核表达载体pcDNA3. 1 /SP-scFv-Fc，从而在来源上保证了抗体的人源性，克服了scFv 稳定性较差、血清半衰期短的缺陷，并恢复Fc 段功能，如抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用等生物学效应。由于前期构建的载体表达水平不高，给蛋白纯化带来困难，本研究尝试将重组基因SP-scFv-Fc插入到真核表达载体PMH3EN中以期提高蛋白表达水平，为后期scFv-Fc 的大量制备打下基础。 　　1 材料和方法 　　1. 1 材料 　　真核表达载体PMH3EN购自杭州安普生物科技有限公司;总RNA 提取试剂盒与通用DNA 纯化回收试剂盒均购自Tiangen 公司; DNA Marker、DNA 限制性内切酶与连接酶、DNA 聚合酶等均购自TaKaRa 公司; ST2 购自Sino BiologicalInc 公司; CHO k1 细胞、Topo10 感受态细胞与人IL-33 由四川医科大学基础医学院保存; G418 购自Beyotime 公司;LipofectamineTM2000 转染试剂与胎牛血清( fetal bovine serum，FBS) 购自Gibco 公司; HRP 标记的山羊抗人IgG1 Fc 抗体购自Abcam 公司。 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 构建重组载体PMH3EN /SP-scFv-Fc 限制性内切酶HindⅢ与Not Ⅰ双酶切构建的重组质粒pcDNA3. 1 /SP-scFv-Fc，回收SP-scFv-Fc 并插入质粒PMH3EN 中，重组质粒转化Topo10 感受态细胞，PCR 鉴定并测序。 　　1. 2. 2 CHO k1 细胞的培养与转染CHO k1 细胞用DMEM培养基( 含10 mL/L FBS) ，于37℃、50 mL/L CO2的条件下培养。测G418 筛选浓度与维持浓度。取细胞悬液于6 孔板中，当细胞生长至汇合度80%左右时，将测序验证正确的重组质粒PMH3EN /SP-scFv-Fc 以及前期构建的重组质粒pcDNA3. 1 /SP-scFv-Fc 分别用脂质体转染法转染CHO k1 细胞( 具体方法按说明书进行) ，未转染的CHO k1 细胞为对照。转染24 h 后，G418 加压筛选，每3 ～ 5 d 换1 次液，培养21 d后换维持培养基培养。 　　1. 2. 3 反转录PCR 检测IgG1 Fc 的mRNA 水平提取转染细胞总RNA，以总RNA 为模板反转录合成cDNA，扩增IgG1Fc 段，引物为Fc-F-BamHⅠ/Fc-R-NotⅠ，beta;-actin 为内参，引物为P1 /P2，未转染细胞为对照，引物序列参照文献。 　　1. 2. 4 Western blot 法检测scFv-Fc 蛋白水平提取细胞总蛋白，SDS并电转移至NC 膜。封闭液封闭1 h 后，用HRP 标记的山羊抗人IgG1 Fc 抗体( 1∶5000) ，孵育1 h; 洗涤3 次，化学发光显影，beta;-actin 为内参。 　　1. 2. 5 Western blot 法检测转染的CHO k1 细胞培养上清中scFv-Fc 蛋白含量及生物学活性CHO k1 细胞生长汇合度达85%时，换无血清培养基。32℃、50 mL/L CO2培养3 d，Western blot 法检测细胞上清中目的蛋白的表达。用人IL-33抗原进行SDS并电转至NC 膜上，以细胞上清中分泌的scFv-Fc 为一抗，HRP 标记的山羊抗人IgG1 Fc 抗体为二抗，检测转染的CHO k1 细胞分泌的scFv-Fc 是否具备与抗原IL-33 以及与抗人IgG1 Fc 结合的能力。 　　1. 2. 6 稳定高表达细胞株的筛选细胞经G418 加压筛选后，取1000 个细胞接种于软琼脂培养皿中，37℃培养至形成肉眼可见的克隆，挑取96 个克隆分别种于96 孔板37℃培养。当细胞汇合度约85%时，换为无血清培养基。32℃培养3 d，每个克隆取5 mu;L