CYP3A41G依赖的CYP3A4内含子10启动的真核表达载体构造.docVIP

CYP3A41G依赖的CYP3A4内含子10启动的真核表达载体构造 　　CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员，占P450酶系总量的30%～40%，主要分布在肝脏和肠道。它参与了许多药物和外源性毒物的氧化代谢，可代谢约50%的临床常用药物。研究表明，人肝脏中CYP3A4的表达及其活性存在着明显的个体差异，并且这种差异90%与遗传多态性有关。CYP3A4*1G(rs2242480)是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性(SNP)，其等位基因频率在亚洲和南非人群中超过20%。研究表明CYP3A4*1G与阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼等药物的剂量、疗效及药代动力学改变有关。前期体外研究发现，在HepG2细胞中CYP3A4内含子10具有启动子活性，并被CYP3A4*1G等位基因依赖性调控，但CYP3A4*1G调控的CYP3A4内含子10与CYP3A4基因表达之间的关系尚不清楚。该研究分别构建了由CYP3A4启动子和CYP3A4*1G依赖的CYP3A4内含子10启动的CYP3A4真核表达载体，并将其转染入HepG2细胞，检测CYP3A4mRNA的表达情况。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒、pGEMCYP3A4为浙江大学药学院药物分析与药物代谢研究室曾苏教授惠赠。携带CYP3A4*1G(GG/AA)的基因组DNA来自河南汉族健康志愿者，由郑州大学基础医学院药理教研室保存。质粒小提试剂盒(Axygen公司)，胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，限制性内切酶(NEB公司)，T4DNA连接酶(TaKaRa公司)，PrimeSTARMaxDNA聚合酶、感受态DH5alpha;和反转录试剂;TriPureIsolation试剂(罗氏公司);SYBRSELECTMASTERMIX(Life公司)、Invitrogenlip2000。PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。仪器设备主要有超净工作台、PCR扩增仪、Nano-Drop2000c分光光度计、37℃摇床、离心机、水平电泳仪、ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪等。 　　1.2质粒扩增 　　将pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒、pGEM-CYP3A4质粒分别转化到DH5alpha;感受态细胞内，使其随细胞的繁殖而复制扩增，然后用质粒小提试剂盒提取质粒并测定浓度备用。 　　1.3目的片段的扩增、纯化及回收根据NCBI数据库中CYP3A4cDNA(NM_017460.5)设计引物，在上、下游引物的5#39;端分别加上EcoRV和XbaⅠ酶切位点和保护碱基。根据NCBI数据库中CYP3A4基因(AF280107)5#39;端上游启动子区序列设计引物，在上、下游引物的5#39;端分别加上MluⅠ和NheⅠ酶切位点和保护碱基。根据CYP3A4基因(AF280107)内含子10全长序列设计引物，在上、下游引物的5#39;端分别加上MluⅠ和NheⅠ酶切位点和保护碱基。PCR引物序列见表1。扩增CYP3A4cDNA所用模板为pGEM-CYP3A4质粒DNA，扩增CYP3A4启动子、CYP3A4内含子10所用模板为人类基因组DNA。PCR反应体系:PrimeSTARMaxDNA聚合酶(2times;)25mu;L，上、下游引物各3mu;L，模板DNA4mu;L，超纯水补至50mu;L。反应条件为98℃10s，65℃15s，72℃2min，30个循环。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，按胶回收试剂盒说明书操作，回收目的片段并测浓度。 　　1.4pcDNA3.1-3A4重组质粒的构建 　　用EcoRV和XbaⅠ双酶切空质粒pcDNA3.1/Hygro(+)、PCR产物CYP3A4cDNA片段，纯化回收后测DNA浓度，16℃连接过夜。连接产物转化到DH5alpha;感受态细胞，涂在含氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上，根据培养板菌落生长情况挑取单克隆，提取质粒DNA，用BamHⅠ进行酶切验证。阳性质粒pcDNA3.1-3A4送立菲生物技术有限公司测序。 　　1.5CYP3A4启动子及CYP3A4*1G依赖的CYP3A4内含子10启动的真核表达载体的构建 　　用MluⅠ和NheⅠ双酶切重组质粒pcDNA3.1-3A4、PCR产物CYP3A4启动子及内含子10DNA片段，纯化回收测DNA浓度，16℃连接过夜。然后转化、筛选、提取质粒，质粒DNA用MluⅠ和NheⅠ双酶切验证。阳性质粒pcDNA3.1-P3A4(CYP3A4启动子重组质粒)、pcDNA3.1-W3A4(CYP3A4内含子10野生型重组质粒)和pcDNA3.1-M3A