CD40配体对汉黄芩素抗肿瘤作用的影响及其机理讨论.docVIP

CD40配体对汉黄芩素抗肿瘤作用的影响及其机理讨论 　　CD40属于肿瘤坏死因子受体(tumor　necrosisfactor　receptor，TNFR)超家族，主要表达于不同分化阶段的B细胞、造血前体细胞、T 细胞、单核/巨嗜细胞、树突状细胞以及多种不同组织来源的肿瘤细胞。CD40 配体(CD40L)属于TNF 超家族。CD40与其配体CD40L结合，为T细胞和B细胞活化提供必需的第二信号，广泛地参与了细胞免疫、体液免疫和炎症反应的调节。而肿瘤细胞表面的CD40与CD40L结合后，对不同类型的肿瘤细胞发挥不同的调控作用，在许多肿瘤细胞可阻止细胞的生长，诱导肿瘤细胞的凋亡，因而CD40L具有潜在的抗肿瘤应用前景。 　　汉黄芩素(5，7 二羟基-8 甲氧基黄酮，Wogonin)是传统中草药黄芩中提取出来的一种活性成分。大量研究表明，汉黄芩素具有广泛的生物活性，包括抗氧化作用、抗病毒、抗血栓和抗炎症等作用。近年来，汉黄芩素的抗肿瘤作用引起关注，体内外研究表明，其对肿瘤的生长具有抑制作用，并能有效杀伤肿瘤细胞。 　　基于CD40L和汉黄芩素在肿瘤治疗上均具有潜在应用前景，本研究采用重组可溶性CD40L(rsCD40L)激活CD40，以卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象，通过比较rsCD40L、汉黄芩素单用和两者合用对SKOV3 细胞杀伤作用的不同，探讨rsCD40L对汉黄芩素抗肿瘤作用的影响，并通过荧光染色观察细胞凋亡、酶联免疫吸附(ELISA)检测肿瘤坏死因子alpha;(TNF-alpha;)和免疫蛋白印记技术(Western　blot)检测凋亡信号通路相关蛋白的表达等考察其作用机理。 　　1　材料和方法 　　1.1　细胞株和主要试剂 　　人卵巢癌细胞株SKOV3购自美国AmericanType　Culture　Collection公司;高糖DMEM(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone);汉黄芩素(中国药品生物制品检定所);吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)购于美国Sigma 公司;pan-caspase 制剂Z-VAD-FMK(Calbiochem 公司);CytoTox　96○R非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司);抗caspase-3抗体(Epitomics公司);抗caspase-8抗体及抗多聚ADP核糖聚合酶(poly　ADP-ribose　polymerase，PARP)抗体购于BD　Bioscience公司;TNF-alpha;中和抗体、rsCD40L、抗beta;-actin抗体(Protein　Tech 公司);化学发光底物液(Millipore)。 　　1.2　方法 　　1.2.1　细胞培养 　　SKOV3培养于高糖DMEM 培养基(含10%的胎牛血清)中，在5% CO2、37℃、饱和湿度下培养，细胞长满80% 时(3～4d)，用0.25%胰蛋白酶液消化后进行传代。 　　1.2.2　实验分组 　　生长良好的SKOV3细胞过夜培养后，分为加入rsCD40L1mu;g/mL(细胞死亡率测定rsCD40L为加入0.5、1.0、2.0mu;g/mL)，或者汉黄芩素10mu;mol/L(细胞死亡率测定汉黄芩素为加入5、10、15mu;mol/L)单药组，以及加入这两种药物的联合用药组，同时设立对照组，每个药物浓度均设4复孔。 　　1.2.3　细胞死亡率的测定 　　将SKOV3细胞接种在96孔板，按1.2.2分组加入不同药物后，继续培养72h，按照CytoTox　96○R试剂盒说明书检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性，测定细胞死亡率。分别检测细胞培养上清吸光度(A)值和细胞最大释放A值。按下列公式计算细胞死亡率：细胞死亡率(%)=细胞培养上清A值细胞最大释放A值times;100%. 　　1.2.4　AO/EB染色检测细胞凋亡 　　将SKOV3细胞接种于48孔板中过夜培养，按1.2.2分组加入不同药物后，继续培养24h，移去上清，用PBS液轻柔清洗并移去后，加入终浓度均为50mu;g/mL 的AO/EB染液，5min后弃去，加入少量PBS，置于荧光显微镜下观察并拍照。早期凋亡细胞的核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状，晚期凋亡细胞的核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。 　　1.2.5蔒眀Mm!E浧 　　Western　blot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达　将SKOV3细胞接种于48孔板中过夜培养，按1.2.2分组加入不同药物后，分别于加药后14h和24h用PBS洗涤后收集细胞，加入M2裂解液裂解细胞，冰上孵育30min，4℃离心，收集上清即获细胞裂解液。用BIO-RAD　protain　assay试剂测定蛋白浓度后，取等量(大约50mu;