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Beclin1基因研究 　　Beclin1基因也称BECN1基因，是一种自噬相关基因，它与Bcl-2基因相互拮抗调控自噬。自噬是细胞中初级溶酶体处理内源性底物的重要过程，同时参与维持细胞内蛋白代谢平衡及内环境稳定的维持，在清除废物、结构重建以及细胞生长发育中起重要作用。近来Ⅱ型程序性细胞死亡-自噬性细胞死亡研究迅速受到人们的关注。自噬曾被Science评为全球科技领域6个研究热点之一。然而自噬性细胞死亡研究主要集中在肿瘤学领域，在寄生虫学领域还很少得以开展，目前已有关于自噬在弓形虫感染致病中的作用的研究报道，其中一种观点认为细胞自噬通过降解作能清除进入胞内的弓形虫保护正常细胞不被感染，另一种观点认为自噬参与弓形虫感染复制过程，抑制了宿主细胞自噬就抑制了弓形虫的增殖。然而关于细胞自噬在弓形虫感染致病过程中的具体作用，自噬途径能否成为抗弓形虫治疗的新靶点等还有待于深入研究。 　　本研究拟构建Beclin1基因的真核表达载体并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入293T细胞，再以Western　blot的方法验证其在真核细胞内的表达，为进一步探索外源性Beclin1基因对弓形虫生长、增殖及新的致病机制等提供基础资料。 　　材料与方法 　　1　材料 　　1.1　细胞和载体 　　293T细胞和真核表达载体pEGFP均由安徽医科大学病原生物学教研室保存。 　　1.2　主要试剂及仪器 　　质粒小量提取试剂盒为美国Axygen公司产品，Trizol试剂和Lipo2000为美国Invitrogen公司产品;BamHⅠ、EcoRⅠ和rTaq　mix为日本TaKaRa公司产品;逆转录试剂盒为美国Fermentas公司产品;DNA 胶回收试剂盒为德国QIAGEN公司产品;鼠抗pEGFP为英国Abcam 公司产品;HRP标记山羊抗鼠IgG为北京全式金公司产品。 　　2方法 　　2.1　RT-PCR扩增目的基因 　　根据Trizol试剂说明书提取293T细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒步骤将RNA逆转录成cDNA。以cDNA 为模板，以beclin1基因编码区全长扩增引物Beclin1-F(5prime;-CGGAATTCTATGGAAGGGTCTAAGACGTCC-3prime;)和Beclin1-R (5prime;-CGGGATCCTCATTTGTTATAAAATTGTGAGGACA-3prime;)，进行PCR 反应。取PCR产物5mu;l，用含EB的1%琼脂糖凝胶进行电泳，分析PCR扩增结果，按DNA胶回收试剂盒的说明进行目的片段的回收和纯化。 　　2.2　PCR 产物和载体pEGFP的酶切及纯化 　　取PCR产物10mu;l，用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切反应，根据DNA 胶回收试剂盒说明进行酶切片段的回收和纯化。 　　2.3　Beclin1基因与pEGFP的重组与鉴定 　　将双酶切后胶回收的Beclin1和pEGFP按摩尔比3～10︰1的比例用1mu;l　T4连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化大肠埃希菌DH5alpha;并进行培养，从培养12h～16h的卡那抗性培养平板上挑取若干单克隆，分别放入3ml含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃以200r/min振摇过夜，按照质粒提取试剂盒说明提取质粒。采用双内切酶切法和PCR法鉴定重组基因，双酶切、PCR鉴定正确的重组表达质粒送上海生工公司测序，并进行Blast比对分析。 　　2.4　Beclin1基因在真核细胞内的表达 　　通过脂质体介导的方法分别将空载体pEGFP和pEGFP-Beclin1重组质粒转染到293T细胞内，24h后用荧光显微镜观察转染情况，提取转染后细胞总蛋白，采用Westernblot检测Beclin1基因编码蛋白的表达情况。 　　结　果 　　1　目的基因Beclin1PCR扩增提取293T 细胞的总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，用Beclin1基因全长扩增引物Primer-F和Primer-R扩增得到Beclin1基因全长编码区片段，大小为1　353bp，与预期值一致。 　　2　pEGFP-Beclin1重组载体pEGFP-Beclin1的鉴定pEGFP-Beclin1经过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切得到1　353bp目的基因片段和约4　700bp的载体pEGFP片段，经上海生物工程试剂公司测序，测序结果经Blast比对与beclin1基因序列同源性为100%。 　　3　Beclin1蛋白在真核细胞内的表达用LiPo　2000分别介导pEGFP和pE