《实验1大肠杆菌的培养与分离》解读.docVIP

实验1：大肠杆菌的培养与分离 解读 定海一中黄 敏◆实验考点整合 1．大肠杆菌 是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般无害。是原核生物，是基因工程中广泛采用的工具。 2．培养基 ①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 ②种类：a．根据物理性质分：液体培养基、半固体培养基、固体培养基；b．根据用途分：选择培养基、鉴别培养基、基础培养基；c．根据化学组成分：合成培养基、天然培养基。 ③配制原则。a．目的要明确：根据微生物的种类、培养目的选择不同的原料配置培养基；b．营养要协调：配制培养基时要注意各营养物质的浓度和比例，pH要适宜。 ④营养构成。a．各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐；b．不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 ⑤LB液体培养基。本实验中大肠杆菌的培养就用到LB液体培养基。其配制方法如下：50ml LB液体培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。（如配LB固体培养基，则再加入1g琼脂。） 3．无菌技术 ①消毒和灭菌的区别： 条件 结果 常用的方法 消毒 较为温和的化学或物理方法 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子） 煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药剂消毒法 灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌 注意：酒精消毒时，体积分数为70%的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。 ②灭菌操作。a．灭菌原因：为了获得纯净的培养物，关键是防止外来杂菌的入侵污染，因此，在培养微生物时必须进行无菌操作；b．无菌操作的条件：各种器皿必须是无菌的，各种培养基必须是无菌的，菌转移操作的过程必须是无菌的；c．灭菌方法：常用高压蒸汽灭菌法，即在121℃（1kg/cm2压力）下灭菌15min；灼烧灭菌，如接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌；利用紫外灯照射灭菌。 4．细菌的培养、分离与保存 ①细菌的培养。a．细菌以分裂方式繁殖，分裂速度很快，条件适宜时，20分钟可分裂一次；b．如要将已有细菌培养物转移到新的培养基时，一般用接种环转移带菌的培养物。 ②细菌的分离。a．平板划线法：用接种环在琼脂固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步分散到培养基表面，培养10~20小时后，可以分离到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的细胞群，即菌落；b．稀释涂布分离法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，然后进行培养；c．两种方法比较：划线分离，方法简单；涂布分离，单菌落更易分开，但操作复杂些。 ③菌种的保存。a．短期保存：固体斜面培养基上4℃保存，菌种易被污染或产生变异；b．长期保存：—20℃甘油管在冷冻箱中保存。 实验步骤 培养基灭菌自三角瓶向培养皿中转移并分装固体培养基将大肠杆菌自斜面转移到三角瓶中的液体培养基中培养将菌液在固体平面培养基上划线分离菌种保存◆实验结果及相应结论 若观察到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离了。 ◆实验注意事项 1．倒平板注意事项：a．平板冷凝后将平板倒置，防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基中，造成污染；b．在倒平板的过程中，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，防止空气中的微生物在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 2．平板划线操作注意事项：a．第一次划线及每次划线之前都需要灼烧灭菌；b．灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种；c．划线过程中，接种环只在菌液中蘸取菌液一次；d．划线时最后一区域不要与第一区域相连；e．划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。 ◆问题与思考 1．如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？ ①胆大心细，操作快捷。 ②注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间，对污染源的改善考虑周到。 ③注意微生物的生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜37℃的温度；而霉菌喜中性偏酸性的环境，喜糖类丰富的物质营养，喜25~30℃的温度。因此，可以根据不同微生物的“喜好”来减少污染。 2．细菌进行恒温培养时，为什么要将培养皿倒置？ 恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已经形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。 3．完成实验后，接触过细菌的器皿应如何处理？ 实验完成后，所有接触过