00120netDNA重组技术.ppt

* * 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。 6 重组体的转化及鉴定 转化 * 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 感受态细胞(Competent cells): * 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； 将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，加入抗生素后进行筛选带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。 重组克隆的筛选 * 小规模制备质粒DNA进行酶切及电泳分析； ?-互补法； PCR以及杂交筛选的方法。 最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切后电泳分析。 重组克隆的鉴定 * 重组DNA转化细菌过程示意图 对于带有LacZ基因的载体可以结合?-互补现象来筛选。在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(?)基因的失活，破坏?-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 ?-互补作用 * 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法 DNA杂交直接鉴定 * 外源基因的表达 细菌中，可以直接用含有目的基因重组体的细菌扩大培养，也可以通过感受态细胞的转化到一特定的菌株中表达； 酵母中，通过感受态细胞的转化； 哺乳动物细胞中，通过细胞的DNA转染技术； 植物体中，借助于转基因技术； 动物体中，借助于转基因技术。 细菌克隆 一般克隆基因的检查和鉴定方法 酶切和电泳, 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段, 磷酸基团带负电荷 酶切后的电泳结果（鉴定） 酶切鉴定 lacZ表达?半乳糖苷酶，含IPTG和X-gal，X-gal被?半乳糖苷酶水解成兰色。 利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒 利用核酸杂交技术直接鉴定携带克隆基因的菌落 脂质体转染法 病毒介导法 农杆菌介导法 A * 重组DNA技术的一般操作步骤有：(1)获得目的基因；(2)构建重组质粒；(3)转化受体细胞；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养转化细胞获得所需性状或所需产物。 获得目的基因的方法有：提取总DNA构建基因文库并从中调用；以mRNA为模板合成互补DNA片段；利用PCR特异性扩增所需目的基因片段等。用紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。 用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复制，这种过程称为基因的克隆。 凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定DNA片段最常规的实验技术。可依据DNA分子的大小来使其分离。还可以利用DNA杂交技术直接鉴定带有重组质粒的细菌克隆。 利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用Southern杂交对转基因生物外源目的基因进行检测分析。 小结 * * 12. 重组DNA技术 * 1 DNA重组的概念及意义 2 DNA重组相关技术 3 DNA重组主要步骤 4 获得目的基因 5 DNA重组体的构建 6 重组体转化及鉴定 内容： * 1 DNA重组的概念及意义 DNA重组技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。是指将外源目的基因片段通过DNA连接酶的作用插入到质粒载体中的过程。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤，利用了多种相关技术。 DNA重组的起始过程本质上是一个酶促生化过程，DNA片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。 * DNA重组技术促进了分子生物学迅速发展，给人类探索自身生命的奥秘展示了光明的前景； 生命关键的基础在于蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸的相互作用，生物大分子的结构与功能的联系正是生命“活”的本质所在。凭借DNA重组技术人们可以克隆获得天然的或任意设计的核酸序列，可以大量获得过去