骨髓基质细胞的体外培养和分化诱导.docVIP

骨髓基质细胞的体外培养和分化诱导 刘大鹏1 艾合麦提·玉素甫1 古丽2 穆合甫尔1 1 新疆医科大学第一附属医院骨研所; 2 包研所细胞室,乌鲁木齐 830054 组织工程技术和干细胞治疗技术是近年来一个新兴的高技术研究领域, 它是众多相关学科，如细胞生物学、细胞培养技术、生物化学、免疫学、外科学、生物材料、分子生物学和基因工程技术等一系列科学理论和技术发展到一定阶段相结合的产物,目前这一技术已被应用于人体各系统疾病治疗的研究中,有些已应用于临床[1]. 成骨细胞体外培养是制造组织工程骨的基础, 而利用组织工程骨治疗各种临床上的骨缺损疾病是非常有前途的发展方向.目前认为骨髓基质细胞（BMSc）经由体外培养进行诱导,转化为成骨细胞，作为组织工程骨的种子细胞,是一种创伤小,取材方便，最具临床应用前途的方法[2].本实验旨在建立一种BMSc向成骨细胞转化的体外培养方法，为进一步进行骨组织工程的研究建立一个技术平台。 1 材料和方法 1.1 实验材料 4~8周龄的健康新西兰大白兔，雌雄不限, 体重2~3kg左右。 1.2 取材 提前一天将新西兰大白兔双侧股骨大转子处用脱毛剂备皮。实验中0.5%的碘酒和75%酒精消毒、铺洞巾。用7号静脉输液器针头穿刺兔耳缘静脉，并用胶布固定好后接5ml注射器（内装0.25%硫喷妥纳液。) ，按1ml每kg体重给药。在实验过程中可随时追加给药。用常规成人骨穿针，于兔股骨大转子顶部穿刺进入股骨髓腔。用50ml注射器抽好5ml肝素生理盐水溶液的。抽出骨穿针针芯，接好50ml注射器，先向髓腔中注入少量肝素液，再回抽可见淡红色骨髓，尽可能将骨髓全部抽出，直至见到少量红色鲜血为止。同方法抽取另一股骨骨髓，穿刺后立即将骨髓进行培养。 1.3 细胞培养 将上述骨髓、肝素及少量血液的混合物，加入含15%胎牛血清的低糖DMEM完全培养基10ml中，将上述细胞悬液先后用80和100目不锈钢滤网过滤两次，根据细胞悬液的体积分别接种于50ml或75ml培养瓶中（一次性塑料培养瓶较好）。细胞密度3×106/ml，置于37度，5%CO2孵箱中，3d后半量换液，以后2-3d全量换液一次。待细胞汇合成单层后消化，以1×105/ml接种于培养瓶中，进行传代培养，传代培养2组，一组使用条件培养基(DMEM培养基中加入地塞米松10-8mmol/L、β-甘油磷酸纳10mmol/L。)，另一组仍使用完全培养基。二组细胞持续培养20-30天，常规3天换液一次。进行形态学观察和组织化学检测 [2~5,610]。 1.4 形态学观察 倒置显微镜逐日观察细胞生长情况及形态变化。 1. 5 组织学检测 将培养3周的附着有细胞的载波片取出，采用偶氮偶联法进行碱性磷酸酶染色。每张载波片随机计数100个细胞，计算ALP阳性细胞率。 1.6 统计分析 使用SPSS 10统计软件对数据进行分析。 2 实验结果 2.1 倒置显微镜观察： 骨髓肝素血液组成的细胞悬液接种后，因含有大量悬浮血细胞，透光性极差, 无法观察细胞形态。3d后，半量换液，逐渐出现贴壁细胞,5ｄ后完全换液除去大部分血细胞,此时贴壁细胞为单个或几个细胞的克隆,细胞形态均一,为长梭形,细胞增殖迅速,10～14ｄ细胞融合成单层(图1)，此时传代细胞于24h全部贴壁。胰蛋白酶消化传代的细胞,形态与原代细胞相似,7～10ｄ达到融合。 贴壁后，条件培养基组细胞生长速度较普通培养基组明显减慢。诱导48ｈ,部分细胞由长梭形变为立方形,进而转变为多角形,体积增大,诱导第8天,几乎所有的细胞均转变为多角形,细胞持续增殖、重叠,逐渐聚集形成多个散在的细胞结节。14ｄ后可见钙沉积出现，形成钙结节(图3)。如对条件培养基组细胞连续传代（每4d一次），则不能形成钙结节。 普通培养基组细胞形态无明显变化,有接触抑制现象，无细胞结节和钙化结节的出现。4d左右可形成单层，可连续传代20代以上，维持2月以上。后期细胞也逐渐变为多角形，体积明显变大。在形态上与条件培养基组细胞似无明显差异。传10代以后再加入培养条件培养基仍能形成钙结节。 2.2 组织学检测 条件培养基组细胞培养3周后，采用偶氮偶联法进行ALP染色，ALP阳性细胞率＞80%，普通培养基组细胞ALP染色大部分为阴性。两组差异显著P＜0.001。 3 讨 论 3.1 分离方法 目前认为骨髓基质细胞经由体外培养进行诱导,转化为成骨细胞，作为组织工程骨的种子细胞,是一种创伤小,取材方便，最具临床应用前途的方法， 但方法仍不十分成熟。目前用于分离BMSc的方法主要有3种，即密度梯度离心法、贴壁筛选法和流式细胞仪分离法。密度梯度离心法是根据间充质细胞与其他细胞密度不同，用分离液分离的方法。贴壁筛选法是根据间充质细胞能在培养瓶中贴