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纸层析法分离氨基酸 班级姓 名 ：学号： 同组同学：实验日期：实验目的 1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术 2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。实验原理 用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下而上移动，称上行法；由上而下移动的，称为下行法。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于他们分配系数不同，不同氨基酸随流动相的移动速度就不同，于是将各种氨基酸分离开，形成距离远点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用值表示： 只要条件不变，值是常数，故可以根据值作定性依据。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的值相同或相近，此时如用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动，再用另一种展层，从而就达到分离的目的，这种方法称为双向纸层析法。 氨基酸无色、利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性和定量。实验器材和药剂1、实验试剂1、氨基酸标准液(1mg/mL) 亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。2、80%甲酸3、0.1%茚三酮丙酮溶液4、氨基酸混合液5、正丁醇6、蒸馏水2、仪器1 、新华滤纸2、培养皿3、电热鼓风干燥箱4、吹风机5、毛细管6、针、线、尺。7、钟罩实验步骤滤纸：选用国产新华 1号滤纸， 6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。显色：待展层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。数据处理和计算亮氨酸甘氨酸脯氨酸待测氨基酸原点到层析点中点距离5.9cm1.5cm2.5cm1.62.65.9原点到溶剂最前沿距离8.0cm8.0cm8.0cm8.0cm0.73750.21430.31250.20.3250.7375判断待测氨基酸待测氨基酸应为亮氨酸，甘氨酸脯氨酸的混合物思考与讨论为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统?答：在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近，不易明显分离时，应用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分开，而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开，大大的提高了分离效果。酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?答：酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影响?答：你往溶剂系统中对于加入碱，对于酸性氨基酸来说，羧基会更多的解离，自然Rf降低。而对于碱性氨基酸的盐溶液来说，解离度降低，Rf增大。 你往溶剂加酸，对于酸性氨基酸来说，羧基变化不大，氨基接受质子更多解离，Rf降低。对于碱性氨基酸，解离度增大，Rf也减小4、什么是分配系数？答：当溶质在两种互不兼容的溶剂中分配时，在温度达到一定平衡时，溶质在两相的浓度比值，,有效分配系数，分别代表A相和B相的体积。注意事项：使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。从结果中所得到的的心得在做实验前,一定要将课本上的知识吃透,因为这是做实验的基础,否则,在老师讲解时就会听不懂,这将使你在做实验时的难度加大,浪费做实验的宝贵时间老师还会根据自己的亲身体会,将一些课本上没有的知识教给我们,拓宽我们的眼界,使我们认识到这门课程在生活中的应用是那么的广泛.真正是我们受益匪