细胞培养入门.docxVIP

细胞培养总结新手首次培养细胞首先要让负责人（负责带你的那个人或细胞间管理者）带你操作数次，完全清楚操作流程及注意事项后方可自己独立操作。超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、10μl、200μl、1ml），酒精灯1台，负压吸液器1台，离心管架一1个，酒精棉球缸1个，酒精喷壶1个，废液缸缸1个，吸头一套（白黄蓝各一盒）。常规耗材：培养瓶（50 cm2），培养皿（35、60、100 mm），6/24/48/96孔板，冻存管。所需试剂：培养基（DMEM/F12 1:1、DMEM高糖、RPMI1640等），胎牛血清（FBS），双抗（青霉素+链霉素），DMSO胰酶，75%酒精……实验前准备所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内；用酒精喷壶喷洒实验台面，打开超净台和细胞间紫外灯，照射30min。配置所需培养基（培养基的配置：基础培养基+胎牛血清（FBS）+双抗，不同种类细胞所用基础培养基种类和血清比例可能不同，个别种类细胞需要添加EGF、TGF等细胞因子，培养基配制要根据需要量按照比例酌量配置，配完的置于37℃预热。首次传代前细胞的复苏打开水浴锅预热到37℃，将装有细胞的冻存管从液氮中拿出，迅速置于37℃水浴锅，连续晃动，1 min内迅速融化。开启超净台正常工作状态（开前窗，通风，开照明灯），用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧。（若是一次性培养皿（瓶）就不需要此操作了）。将融化的细胞液转入含有5mL培养基的15mL离心管，800 r/min, 离心5 min。去掉上清，加入适量培养基吹打均匀，传入细胞培养皿（瓶），培养瓶需要旋开瓶口少许。将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。将培养皿置入37℃，5%CO2培养箱。12小时候查看细胞状态及密度。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在达到传代密度之前如果细胞培养基颜色由鲜红色变为红棕色或黄色，说明细胞代谢废物增多，需要更换培养基（注意，培养基颜色变黄也有可能是细胞被污染，要及时处理掉）。培养液的更换紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。将所需的培养基（已预热）确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，4．用移液器悬空进入培养基瓶内吸取适量培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放。5． 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。将培养瓶放于37℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度达到90%，即可进行细胞的传代。细胞传代紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。将所需的培养基和胰酶（已预热）确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，4．用移液器悬空进入培养基瓶内吸取适量培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放。5． 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6. 将培养瓶放于37℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株（冻存）。细胞株的保存（细胞冻存）紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。用移液器吸取适量胰酶，悬空移入培养瓶内，使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，37℃孵育约1 min，晃动几下培养瓶，在显微镜下观察若细胞触角消失，细胞间出现间隙并有少量细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机，加入含血清培养基终止消化，用移液器反复轻轻吹打2-3遍即可将细胞