高效液相色谱的应用.docVIP

高效液相色谱的应用 摘要：本位介绍了HPLC的应用并建立了快速测定维生素K2的高效液相色谱分析方法。采用Waters 公司的Waters Spherisorb RS5 CN（4.6×250 mm） 分析柱，SP100 型液相色谱仪系统，紫外检测器，V（正己烷）∶V（异丙醇）=99.96∶0.04 为流动相，流速为1.5 mL/min ,柱温为25 ℃， 检测波长为254 nm。维生素K2的线性范围为20～200 mg/L，r2 均大于0.999；加标回收率为98.86%～100.2%；日内精密度小于7.7%，日间精密度小于9.0%。本方法快速、简便、准确、灵敏度高，适用于维生素K2的定量研究。 关键词：高效液相色谱法；维生素K2 高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。高效液相色谱的特点是“三高” “一快” “一广”，即高柱效——n=104片/米，（远高于一般LC)，高灵敏度(紫外：10-9g；荧光：10-11g)高选择性，还有分析速度快(＜1h)和应用范围广泛（可分析80%有机化合物）（是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法）等特点。 一．HPLC应用 1、样品测定 1.1 流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6-15分钟为宜）。所以第一次检验时要少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，要注意充分平衡柱。 1.2 样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。 1.3 记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。 1.4 进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度） 1.5 计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。 1.6 仪器的使用： ①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）。 2、方法研究 2.1 波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。 2.2 流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。 二、高效液相色谱的实际应用——快速测定维生素K2 维生素K2 是2-甲基-1，4 奈醌的衍生物。维生素K2的作用：（1）治疗和预防骨质疏松症，维生素K2生成骨蛋白质，再与钙共同生成骨质，增加骨密度，防止骨折。（2）维生素K2可预防肝硬化进展为肝癌。（3）治疗维生素K2缺乏性出血症，促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的凝血时间。（4）具有利尿、强化肝脏的解毒功能，并能降低血压。通过实验，本文建立了一种快速测定维生素K2 的高效液相色谱分析方法，该方法准确、灵敏度高、流动相体系简单，对仪器要求不高，可满足对维生素K2 的检测要求。其结果对维生素K2 的研究有直接指导作用，将为人群维生素K2 营养状况提供基础数据，并可适用于不同生物样品中维生素K2 的定量研究。 1、实验部分 1.1 仪器与试剂 仪器：SP100 高效液相色谱仪系统；seriesⅢ单泵，CS420X 型色谱