荧光显微镜..docVIP

荧光显微镜讲授流程： 构造 原理 发展史 荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具,它是光学显微镜的一种。它除了具有光学显微镜的基本结构 和光学放大作用外,基于荧光的特性,还具备以下独特的功能要求: (1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。 (2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片,从光源中选择合适的激发光谱,使析出的光谱与 该物质的吸收光谱重合,以期望获得最大的荧光。 (3)为获得较弱的荧光图像,还要建立一套截止滤色片,它使所需观察的荧光进入系统成像,而将其余 的光波,包括发射光阻挡在外,用来提高图像的衬度。 (4)放大的光学系统应适应荧光的特性,最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度 的荧光图像。 (5)仪器的安全性。应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸,保证电器安全。 滤色片初期用贮放玻璃盒中的有色液体,后改用带色胶质片,由于易变色和使用不方便已被淘汰。现 在经常使用的为色玻璃和干涉滤色片,色玻璃大都属宽波带滤色片,透过波段宽,透过率随厚度而降低,价 格相对低廉。由于色玻璃与空气的界面上,约有4%光线被反射掉,玻片愈多,光能损失愈大,限制了它的 使用性能。干涉滤色片的出现,可按需要制成能透过或截止一定波段的滤色片,从而促使荧光显微术的进 展,现代技术上已能对某波段的透射率或反射率进行控制。 荧光显微镜的应用 在环境中检测已知微生物，制作相应的带有荧光素的抗体， 进行标记、定位（免疫荧光技术） 对病原微生物的检测有意义 --- 梅毒密螺旋体 荧光显微镜下的细胞增殖（超链接--视频） 选用不适合同的荧光染色剂，对同一视野下的样品进行染色（复杂环境下） 4. 荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛,在植物细胞的观察研究中,通过染色可以更清晰地观测到细胞的形态及结构。在实验中发现,荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔器,而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜找到了一种新用途。 5. 20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维 等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌。40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等 在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后,用荧光显微镜能够很清晰地观察到活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。利用荧光标记技术显示微管,可以在多种植物生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在 在紫外光激发下,叶绿体发出火红色荧光,气孔发绿色荧光,保卫细胞呈黄色或黄绿色,且形状大小非常清晰,两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少,所以在荧光显微镜下看不到表皮细胞。通过大量试验证明,单子叶,双子叶,裸子植物大都适用于这种方法而且效果较好。  荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式。 透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光。图中用暗场聚光镜 (DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上,截止滤色片(SF)吸收被切片衍射的 杂散激发光,仅透过荧光到目镜(OC)。 DC—暗场聚光镜; OB—物镜; SF—截止滤色片; OC—目镜。 图8　透射荧光显微镜 透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜。明场聚光镜很少直接用于荧光检测中,常用来有哪些信誉好的足球投注网站目标,寻找 或挑选切片需要的区域,这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成,否则会出现衰减甚至猝灭,当仪器 配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜,在调节可变光适当时,也可获得满意的荧光图像。 暗场聚光镜在透射荧光中是必备的,由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗”色,使荧 光衬度大大提高。 荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐,并且能透过紫外线的材料。图9所示是一 种心形暗场聚光镜,它的心脏形反射面将光线高度会聚成一“点”,聚光镜的性能可用下式表征。 E=K?P(NA2max-NA2min) K为透过率。可见其性能取决于聚光束最大数值孔径与最小数值孔径的平方差,差值愈大,性能愈优越。 暗场是用中空的光锥激发切片的荧光物,为得到稳定的荧光图像,聚光镜的调节机构(对中和调焦)应 稳定可靠,可多次重复照明条件。 另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm～1mm之间才获得暗场效应,这是因为受到暗场光 锥顶点深度的限制。好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用。 图9　心形暗场聚光镜