第九章.基因工程与基因组学幻灯片.pptVIP

2.基因工程的发展：　　基因工程的产生和发展在遗传学的发展史上是一次大革命，它打破了种、属的界线，可以在生物大系统内交流基因。其发展情况如下： 1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶 酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年　伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体 DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 得到新的DNA分子。1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。 自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。 1996年，克隆羊诞生。 2004年3月英国批准大面积种植转基因，但要求非常严格。 2005年德国通过法案，严格限制（包括实验室研究）。 3．基因工程研究内容：　　①．从细胞和组织中分离和纯化DNA； 　　②．利用能识别特异性DNA 序列的限制性内切酶剪切DNA分子，制备含有目的基因的DNA片段，或采用酶学和化学合成的方法人工合成基因；　　③．将DNA片段或人工合成的基因与能够自我复制并具有选择标记的载体在体外连接，形成重组DNA分子；　　④．将重组的DNA分子引入受体（宿主）细胞中，使重组DNA分子在受体细胞内复制，产生多个拷贝，即克隆；　　⑤．重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞中，使子代群体细胞均具有重组的DNA分子的拷贝；　　⑥．从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定含有目标基因的重组DNA，受体细胞的克隆； ⑦. 能从选出的宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组的DNA分子； ⑧.克隆的基因能够正常表达。 二、限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶，是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到，这些酶能识别特定的核苷酸序列， 所以称之为限制性内切酶。是基因工程的常用工具酶。 ⑴．限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；　①. EcoR I 来自大肠杆菌（Escherichia coli）；　②. Hind Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。 ⑵．限制性内切酶的类别：根据限制性内切酶的作用特点，可分为两类：第Ⅰ类酶、第Ⅱ类酶 第Ⅰ类酶 ： 如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300，000)， 由于这类酶的切割部位无特异性，是随机的，每隔一段DNA 序列随机切割双链DNA分子，切割点不固定，所以在基因工程中很少应用。　　第Ⅱ类酶（）：　如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20，000-100，000)， 这类酶的切割部位有特异性，可准确切割DNA双链的特异序列，因此在基因工程中广泛应用。 这类酶的切割点是对称序列。如回文对称序列（又称反向重复序列，即从两个方向阅读，其序列相同的序列）。识别特定的碱基序列，交错切割产生二个粘性末端。 二个平齐末端。 三、载体 载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。 载体的条件：　①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复制。　②.具多克隆位点，即有多种限制酶的切点；且切点不存在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记性状的表现。　③.至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基因。　④.易从宿主细胞中回收克隆。 四、基因的分离与鉴定 一般而言，一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片段包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。 DNA的体外重组： 1. 体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接； 2. 目标DNA分子+载体DNA，共价连接； 3. 获得重组DNA分子。 ㈠、从基因库中分离基因：　1. 基因库（gene library）：　　是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。　　根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等 ①. 核基因库 ：　核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA