第八章 蛋白质分析1幻灯片.pptVIP

第八章 蛋白质分析 概论 蛋白质和氨基酸 是一类在所有细胞中含量丰富的成份，除了储备蛋白质外，几乎所有的蛋白质对生物功能和细胞结构都非常重要。 蛋白质是生命的物质基础，人体内的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质代谢及转运都与蛋白质有关 人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标。 食品中的蛋白质种类非常复杂，其中很多已经被纯化和定性。蛋白质分子量的变化范围通常为5000～1000,000道尔顿，它们包括氢、 碳、 氮、氧和硫等元素，二十种常见α-氨基酸是蛋白质的主要构成。蛋白质中的氨基酸残基是由多肽键连结的。 含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志。 由于一些食品的组份具有相似的物化性质而使得对蛋白质的分析变得非常复杂。非蛋白氮可能来自于游离氨基酸、小肽核酸、 磷脂、 氨基糖、嘌呤以及某些维生素、生物碱、尿酸、脲和氨基离子。 因此，食品中的总有机氮主要来自于蛋白质，小部分来自于非蛋白质组份的有机氮，他们会干扰蛋白质的测定。 食品中其他主要成分包括脂类和碳水化合物都完全有可能会干扰食品蛋白质的分析。 蛋白质分析的重要性 1．生物活性测定：一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。 2．功能性质调查：不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛奶中的酪蛋白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡能力。 3．营养标签：当你想要了解以下几个蛋白质指标，就必须进行蛋白质分析。 ⑴总蛋白质含量 ⑵氨基酸组成 ⑶混合物中的特定蛋白质的含量 ⑷蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量 ⑸非蛋白氮 ⑹蛋白质的营养价值（消化率、蛋白质功效比或氮平衡） 蛋白质的测定方法 1凯氏定氮法（1833年Kieldahl,常量法、微量法、自动定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法） 2双缩脲法 3福林酚（Lowry）法 4 Bicinchoninic Acid 法 5 280nm紫外吸收法 6染色法 6.1阴离子染色法 6.2布兰德福特（Bradford）法 7茚三酮法 8比浊法 9杜马斯法（燃烧法） 10 红外光谱法 一、凯氏定氮法（常量） 凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白含量。 此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 原理 样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O，有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。 样品制备 消化 中和、蒸馏 滴定 计算 利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16%的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。 即： %N × 6.25 = %蛋白质 在消化反应中,为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间,常加入下列物质 1）硫酸钾: 提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解,水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反应式如下： K2SO4 + H2SO4 → 2KHSO4 2KHSO4 → K2SO4 + H2O↑+ SO3 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起引起生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。 （2） （催化剂、指示剂）硫酸铜 起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。 指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等也可用的催化剂。 操作步骤 消化 准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热至