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膜片钳与LTP 天津中医药大学第二附属医院 王凯 2014.5 来源和机理 细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。 离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构。 带电离子在膜内外的不同分布态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础。 细胞膜的结构和离子通道 1.结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序列；X光绕射方法确定其三维立体结构。 2.功能研究：电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。 3.结构和功能相结合：利用基因突变技术在一级结构的特定部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变。 如何研究离子通道 美国的两位科学家 彼得·阿格雷 罗德里克·麦金农 利用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构，二位因此获得2003年诺贝尔化学奖。 结构研究 采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术 电压钳(Voltage clamp)技术 膜片钳(patch clamp)技术 离子通道功能观察 20世纪初由Cole发明，Hodgkin和Huxley完善，目的是为了证明动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性。 电压钳技术(Voltage Clamp) cole K+电流 Na+电流 电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点： 微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性。 不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。 对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在10－30μm之间)进行电压钳实验，技术上有更大的困难。 电压钳的缺点 为了弄清膜电导变化的机制和离子通道的存在，也为了克服电压钳的缺点，Erwin Neher和 Bert Sakmann在电压钳的基础上发明了膜片钳，并利用该技术首次在蛙肌膜上记录到PA级(10-12A)的乙酰胆碱激动的单通道电流,首次证明了离子通道的存在。并证明在完整细胞膜上记录到的膜电流是许多单通道电流总和的结果。这一技术被誉为与分子克隆技术并驾齐驱的划时代的伟大发明。二人因此而获得诺贝尔生理或医学奖。 (Neher) (Sakmann) 膜片钳（Patch Clamp) 基本原理 利用尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端和细胞膜形成紧密封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（patch）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定膜电位(clamp)，然后对电极尖端下面积仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。 核心部分是一场效应管运算放大器构成的I-V转换器，它的正负输入端子为等电位。向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，从而达到电位钳制的目的。离子通道电流可作为I-V转换器内的高阻抗反馈电阻的电压降而被检测出。 电子学部件:放大器；计算机接口，数据采集、分析系统。 光学部件和光电接口：显微镜；监视器等。 机械系统:防震台等。 辅助系统：电极拉制器；切片机；孵育槽；灌流系统等 膜片钳实验系统组成 膜片钳的几种记录模式 膜电位或膜电流 单通道电流 1.液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。 2.标本制备 3.记录 4.资料分析： （1）一般电学性质：通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。 （2）动力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型（簇状猝发样开放与闪动样短暂关闭），化学门控性通道的开、关速率常数等。 （3）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率因子K。 （4）药理学：阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。 （5）综合分析得到最后结论。 膜片钳实验的基本过程 250 ms 400 pA mEPSC sEPSC、mEPSC 突触电流 此项技术首先要使电极和细胞形成高阻封接，而要成功形成高阻封接，除了制备合符要求的电极外，制备活性好的细胞是必须的，要求细胞表面光滑，有弹性，表面无麻斑。 如果有关实验要在脑片上进行，就涉及到脑片制作，适用于膜片钳研究的脑片制作尤其是成年动物的脑片制作尤其难，因