【2017年整理】RNAi的实验原理和操作实用技术.docVIP

RNAi的实验原理和操作实用技术几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。RNA干涉（ HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。??? 此后，科学家们明白， HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的 HYPERLINK /biology/Special/genomics/Index.html 基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。 HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi肯定有很多新用途， HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi还可能具有一些仍然有待去发现的天然功能。 HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi实验原理与方法 ??? 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（ HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi）。?? 一、 HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi的分子机制??? 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由 HYPERLINK /Search.asp?Field=TitleClassID=keyword=转基因 转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。??? 在 HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。??? 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.??? 二、如何进行 HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi试验?? (一)siRNA的设计??? 1. 在设计 HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： HYPERLINK /business/products/order2.htm \t _blank /business/products/order2.htm HYPERLINK /techlib/misc/siRNA_finder.html \t _blank /techlib/misc/siRNA_finder.html HYPERLINK /Stu/shilin/rnai.html \t _blank /Stu/shilin/rnai.html HYPERLINK /rnadesign/default.aspx?SID\t _blank /rnadesign/default.aspx?SID??? 2. HYPERLINK /biology/Special/RNAi/Index.html RNAi目标序列的选取原则：??? (