【2017年整理】实验四 提纯的萝蛋白酶的分子量的鉴定080616.docVIP

实验四 提纯的菠萝蛋白酶的分子量的鉴定— SDS 一?? 目的： 1 、学习和掌握电泳（ PAGE 和 SDS—PAGE ）的基本原理及电泳技术。 2 、熟练掌握 SDS—PAGE 有关试剂配制的技术。 二.原理： 电泳 的概念： 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳 (electrophoresis ，简称 EP) 。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 影响电泳的主要因素 泳动速度是一个物理常数，可用来鉴定蛋白质、核酸等物质以及研究它们的一些性质。影响泳动速度的因子有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。 （ 1 ）颗粒性质 一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就快。反之，则越慢。 （ 2 ）电场强度 电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。 （ 3 ） pH 值 对蛋白质而言，溶液的 pH 值离其等电点愈远，其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。 （ 4 ） 离子强度 溶液的离子强度一般在 0.02-0.2mol/kg 之间电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。这种静电作用的结果，导致颗粒泳动速度降低，则缓冲能力差，往往会因溶液 pH 值变化而影响泳动的速率。 （ 5 ） 溶液粘度 泳动度与溶液粘度是成反比例关系。因此，粘度过大或过小，必然影响泳动速度。 （ 6 ） 电渗 当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。溶液的泳动现象称为电渗。因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时则降低颗粒的泳动速度。 （ 7 ） 焦耳热 电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电流强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支持物。 （ 8 ）筛孔 支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。 除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体 (acrylamide ，简称 Acr) 和交联剂 N ， N ˊ - 甲叉双丙烯酰胺 (N ， N ˊ -methylena bisacrylamide ，简称 Bis) ，在催化剂的作用下聚合而成的。 Acr 和 Bis 在它们单独存在或混合在—起时是稳定的，但在具有自由基团体系时，它们就聚合。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种 ，即化学聚合和光聚合。这里介绍化学聚合。 化学聚合 的引发剂是过硫酸铵 [(NH 4 ) 2 S 2 O 3 ]( 简称 Ap) ，催化剂是 N ， N ， N ˊ， N ˊ - 四甲基乙二胺 (tetramethyl ethylenediamine ，简称 TEMED) 。在催化剂 TEMED 的作用下，由过硫酸铵 (Ap) 形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。 TEMED 在低 pH 时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可 使 聚合速度变慢。—些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。 聚丙烯酰胺的基本结构 ：为丙烯酰胺单位构成的长链， 链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链间纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性能。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定 。每 100 毫升凝胶溶液中含有的单体 (Acr) 和交联剂 (Bis) 总克数称为凝胶浓度，用 T ％表示。凝胶溶液中，交联剂 (Bis) 占单体 (Acr) 和交联剂 (Bis) 总量的百分数称为交联度，用 C ％表示。改变凝胶浓度 (T ％ ) 和交联度 (C ％ ) ，可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。—般常用 7.5 ％浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用 2.4 ％的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同。