【2017年整理】实验九 微生物的大小及数量测定.docxVIP

实验九 微生物的大小及数量测定 摘要 通过显微测微尺测量酿酒酵母的长和宽，对其细胞体的大小有一个具体的了解；使用血球计数板对稀释n倍的酵母菌悬液进行细胞数量的测定，从而达到定量了解微生物的生长繁殖情况。 关键词 目镜测微尺 物镜测微尺 血球计数板 前言 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一，也让我们对微生物的实际大小有了一个感性的认识。微生物数量的测定在微生物生长曲线中运用非常重要，我们从微生物的数量上了解其生长状况，这也能指导我们的工业生产。 一、实验目的 掌握测微尺、血球计数板的使用方法； 掌握微生物数量大小及数量测定方法。 二、实验原理 （一）微生物大小的测定 微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 镜台测微尺（图1a）是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格，每格长度等于0．01mm（即106μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是专用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 目镜测微尺（图1b）是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。由于所用目镜放大倍数和物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同。因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小。在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。 图1 测微尺及其安装和校正 （二）微生物数量的测定 显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)-显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血球计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验用血球计数板进行显微镜直接计数。 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽，构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图2。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格(图2)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3(万分之一毫升)。 计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。 25个中方格的计数板，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）同理，16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）。 图2 血球计数板构造示意图 三、实验材料 1、菌种 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae） 2、仪器 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，盖玻片，吸水纸，计数器、滴管，擦镜纸，酒精灯，接种环，试管等。 3．试剂 5%孔雀绿水溶液，香柏油，二甲苯，蒸馏水等。 四、实验步骤 1、目镜测微尺的校正及酵母大小的测定 A目镜测微尺的校正 目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微