轉氨酶硝态氮铵态氮等测定方法.docVIP

六、 氮含量的测定：（2g） 样品提取液的提取: 称取新鲜植物组织2g，加入15ml无离子水研磨成匀浆，置于45℃振荡机中摇动浸提lh后用5ml无离子水冲洗干净，然后离心或过滤(如含色素需用活性炭脱色)，滤液备用。1硝态氮的测定： 标准氮试剂：精称KNO3 0.9021g，溶于少量重蒸无离子水中，并定容至250ml，含N 量为500μgNO3一N／ml。 5％水杨酸一硫酸溶液：称取水杨酸5g，溶于100ml浓H2SO4(比重1．84)中，搅拌溶解后贮于棕色瓶内，冰箱中至多保存l周，最好现用现配。 ?2mol／L NaOH溶液：称取NaOH 80g放入500ml硬质烧杯中，加入重蒸无离子水200ml，溶解后定容至l000ml。 操作方法 标准曲线制作取：50ml容量瓶6只(编号)，依次加入标准氮试剂5、l0、l5、20、25、30ml，用无离子水定容，则成为50、100、l50、200、250、300 ug／ml的氮系列标准溶液；再取干沽50ml三角瓶7只，分别装入上述系列溶液0．2ml，剩下的1只三角瓶加入无离水0.2ml(作为O 点)；然后分别加入5％水杨酸一硫酸溶液0.8ml，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／L NaOH溶液l9ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；并以OD 值为纵座标，以标准氮(0、50、l00、150、200、250、300 ug)为横座标，绘制一条标准曲线(通过原点的直线)。 0.1ml滤液＋0.4ml 5％水杨酸一硫酸溶液，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／L NaOH溶液9.5ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；结果计算 按照公式A= CV1/(WV2) 计算。 式中：A—NO3一N含量(ug／g)；W一样品重(g)；V1一样品提取液总量(m1)：V2一样品反应液数量(m1)；C一样品在标准曲线上查得的N量(ug)：2亚硝态氮的测定： NaN02 标准溶液：精称分析纯NaNO2 0.24643g，以无离子水溶解并定容至50ml,再吸取此溶液5ml定容至l000ml，作为母液，其浓度为5μgNO2一N／ml。 磺胺试剂：称取分析纯磺胺(或对氨基苯磺酸)l0g，加浓HCI 250ml(需用水浴加热溶解)，用无离子水定容至lL。 ɑ一萘胺试剂：称取分析纯ɑ一萘胺2g，加浓HCI 250ml，溶解后定容至1L。 操作方法 标准曲线绘制：取干沽试管6支(0～5号)，依次加入标准NaNO2母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，再依次加入无离子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml：摇匀后再在各管分别加入磺胺试剂和ɑ一萘胺试剂各2ml：摇匀后于35(2水浴中显色30min，于520ml处比色，绘制出标准曲线。 lml样品提取液＋2ml磺胺试剂＋2mlɑ一萘胺试剂，摇匀后于35℃水浴中显色30min，于520ml处比色。 结果计算 按照公式A= CV/W计算。 式中：A— N02一N 含量(μg/g)： C一查标准曲线值(μg)； v一样品提取液总量(ml)； W一样品重(g)3 游离氨基酸态氮的测定： 加完试剂后混匀，盖上大小合适的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而退去，进而呈蓝紫色时，加60%乙醇4.9ml。混匀后用1cm光径比色皿在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。 样品测定 吸取样品滤液1.0ml，放入干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，其他步骤与制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查的含氮量。 按下式计算样品中氨基态氮的含量 式中：C为标准曲线上查的的氨基态氮含量，μg；VT为样品稀释总体积，ml；Vs 为测定时样品体积，ml；W为样品鲜重，g。 附注：（1）茚三酮重结晶的方法：合格的茚三酮应该是微黄色结晶，若保管不当，颜色加深或变成微红色，必须重结晶后方可使用。其方法如下：5g茚三酮溶于15ml水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，溶液太稠时，可适量加水，30min后用滤纸过滤，滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出，用干滤纸过滤，再用1ml蒸馏水洗结晶一次，置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。 （2）茚三酮与氨基酸反应生成的Ruhemans紫在1小时内保持稳定，故稀释后尽快比色。 （3）空气中的氧干扰显色反应的第一步。以抗坏血酸为还原剂，可提高反应的灵敏度，并使颜色稳定，但由于抗坏血酸也可以与茚三酮反应，使溶液颜色过深，故应严格掌握加入抗坏血酸的量。 （4）反应温度影响显色稳定性，超过80℃，溶液易褪色；可在80℃水浴中加热，并适当延长反应时间，效果良好。 4