实验 一、A提取及检测.ppt

实验 一、RNA提取及检测 一、实验目的 掌握植物RNA RNA提取及检测方法 二、实验试剂及材料 水稻叶片、液氮、Trizol试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水 三、实验器材 恒温水浴锅、PCR仪、台式低温离心机、移液枪、研钵、紫外分光光度计，一次性手套。 四、实验步骤 采用Trizol法提取RNA(50－100mg组织∕ml trizol)，以加1ml Trizol为例，操作流程如下： (1) 研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研磨至粉末。加入Trizol（每100mg组织加1ml的Trizol），充分研磨，放在室温下解冻。 (2) 除不溶性物质：2～8oC下12000g离心10min，不溶性物质沉淀，将RNA的上清移入1.5 ml离心管中。 (3)相分离：在15～30℃下放置5min，使核蛋白复合物完全解离。加0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，室温下温浴2～3min。2～8℃下，≤12000g离心15min，RNA全部溶解于上层水相中，把水相移入另一1.5ml离心管中。 (4) 氯仿再次去杂：加0.5ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温下温浴2～3min；2～8℃下，≤12000g离心15min，把水相转入1.5ml离心管中。 (5) RNA沉积：加入0.5ml异丙醇，15～30℃温浴10min；2-8℃下，≤12000g离心10min，RNA沉积在离心管的底部及侧壁。 (6)清洗RNA：加入1ml 75%乙醇，2～8℃下≤7500g离心5min，小心将上清液倒掉。 (7)再清洗：加入1ml 75%乙醇，2～8℃下，≤7500g离心5min，小心将上清液倒掉。 (8)RNA的溶解：将离心管倒扣在吸水纸上5～10min，每管加30μl的DEPC水，可在55～60℃下助溶10min。 (9)RNA浓度：用DEPC水稀释100倍，用紫外分光光度计 测定OD值（260nm、280nm 230nm），估算RNA浓度。-70 ℃保存。 总RNA定量方法? RNA在260nm波长处有最大吸收峰。OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000? RNA浓度检测过程 （1）取少量待测RNA样品，用DEPC 水稀释100倍。 （2）用DEPC 水做空白，在260 nm、280 nm、230 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。 （3）加入待测RNA样品在三个波长处读取OD值。 RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。 OD260/OD230比值应≥ 2.0，若比值较低说明盐分过高。 电泳检测RNA质量： （1）配制1.2%的琼脂糖凝胶（20mL） 称取琼脂糖0.24 g，加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL，5×RNA 电泳缓冲液4 mL，电炉加热融化琼脂糖，冷却至55°C，加入甲醛1.96 mL，冷却后倒胶。 （2）RNA电泳 取去离子甲酰胺10 μL，甲醛1.5 μL，10× RNA Buffer 2 μL，RNA (2～4 μg, 10 μL)混合液，65°C加热15min，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3 μL RNA 加样缓冲液和0.5 μL EB，上样电泳。电泳Buffer 为1× RNA buffer。 （2）RNA电泳结果判别质量： 出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RNA（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA（mRNA）经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28SrRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。 五、总RNA提取常见问题分析 RNA降解 1、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。 2、内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 3、外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷。 OD260/OD280比值偏低1. 蛋白