第四章激光生物学检测与技术概述.ppt

第四章 激光生物学检测  与分析技术 目前，较成熟的激光生物学（细胞）检测分析技术有： 1.激光显微镜：激光共聚焦断层扫描显微镜、激光多普勒显微术； 2.激光光谱分析技术：激光微束技术、激光流式细胞仪分析技术等。 3.激光超短脉冲技术：激光DNA测序技术 一.激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, LSCM）  （激光共聚焦断层扫描显微镜） 独特恒温培养箱 专用CO2培养室, 精确控制CO2浓度、温度、湿度专用加药及显微注射的小孔，可方便加药注射等 在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。   利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，动态扫描记录，三维立体结构。 Non-Confocal Scan of the 3D Reconstruction of Astrocyte by Same Cell Simulated Fluorescence Process 共聚焦系统 普通荧光显微镜的不足 与普通荧光显微镜比较 1.增加了激光扫描部分，可连续、固定范围内小功率扫描，记录动态变化。 2.光学结构为共扼聚焦结构，此结构可使样品中间固定层面被激光扫描，通过调节参数可实现样品的多层扫描，俗称“细胞CT” 1.基本结构 其主要由以下几个部分组成：荧光显微镜主体部分（装有微距步进马达）、激光发生器、扫描器、检测器及电脑调控与图像分析系统，并配备了照片打印、幻灯片输出仪、光盘记录等。 2.主要功能特点 1） 可无损伤地对样品进行逐层断层扫描，并将各层面的连续光切片进行三维立体重构，实现对样品三维立体结构的观察、空间定位、定量测定（面积、厚度、空间距离、体积等）； 2） 能够对活体的各种生理信号（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、膜电位、pH值等）的动态变化及离子分布作毫秒级的动态观察和监测； 3） 利用激光的点光源高能量特点可进行细胞生物学实验，如膜流动性、细胞间通讯、细胞损伤和损毁实验等。 3. 基本原理 原理: Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。 照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。 计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。 焦平面上的一层光切片 只要载物台沿着Z 轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。 小结 * LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，其横向分辨率比普通光镜高，成象聚焦后焦深小，因此也具有较高纵向分辨率。 * 可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三 维重建后能得到样品的三维立体结构  形象的称为显微“CT”。 输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析 具有多个（四个） 荧光通道，可同时对多重染色样品进行观察 采图 g 显示 g 3D g 处理 g 定量 g 注解 主要配制及性能指标 1.激光光源： 配有Ar/ArKr激光器、GreNe激光器、HeNe激光器。 激发波长为: 458nm、476nm、488nm、514nm、543nm、568nm 和633nm Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 2.物镜： （5~40）×物镜、100×油镜；高倍（40×以上）物镜的分辨率为0.3μm，物镜放大倍数精确度达±5%以内。3.总放大倍数： （5~1000）×范围 4.激光分辨率：25