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最低抑菌浓度(MIC)测定.
附件3.4
最低抑菌浓度（MIC）测定
菌悬液的制备
刮取18～20小时的培养物，在管壁上充分研磨后混悬于1ml缓冲液中，借助比浊仪，调菌悬液浓度至104/ml，于1小时内用多点接种仪接种（放置室温应大于25℃）。
MIC测定
抗菌药物储存液制备
抗菌药物称量及配制：根据各抗菌药物的纯度称取，以目前所用抗菌药物为例。
抗菌素 纯度 称量（mg） 加溶剂(ml) 储存液浓度(mg/ml) 四环素 100% 3.2 1 3200 大观霉素 63.4% 40.38 1 25600 头孢曲松 81.5% 2.45 1 2000 环丙沙星 84.4 3.8 1 3200 分装与保存：每管200ml，-70℃可保存一年。
抗菌药物工作液制备
青霉素：
管号 原液 0 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 浓度(?g/ml) 3200 1600 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 取量(?l) 200
→ 200
→ 200→ 200
→ 200→ 200→ 200
→ 200→ 200
→ 200
→ 200→ 200→ 200 溶剂(?l) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
四环素:
管号 原液 0 1 浓度(?g/ml) 3200 1600 800 取量(?l) 200
→ 200
→ 200 溶剂(?l) 200 200 200
大观霉素：
管号 0 7 6 5 4 3 2 1 浓度(?g/ml) 25600 12800 6400 3200 1600 800 400 200 取量(?l) 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 溶剂(?l) 200 200 200 200 200 200 200 200
头孢曲松:
管号 原液 0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 浓度
(μg/ml) 2000 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.4 0.2 取量(μl) 40
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200 溶剂(μl) 360 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
环丙沙星：
管号 原液 0 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 浓度(ug/ml) 3200 1600 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.4 0.2 取量(μl) 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200
→ 200 溶剂(μl) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
抗菌药物梯度培养皿的制备
培养皿编号：按各抗菌药物浓度编号。
将配制好的各抗菌药物工作液150μl加到各培养皿中，与15ml 50℃预温的培养基充分混匀，平放在超净台内，半开培养皿盖至培养基凝固后，用塑料袋密封保存于4℃冰箱。
菌悬液接种与培养
多头接种针以及菌液板用高压法灭菌处理，其他配件用酒精消毒处理；使用前必须确认完全烘干。
按照仪器要求将菌悬液接种于各抗菌药物梯度培养皿，接种菌后置超净台内直至菌悬液渗入。
置35℃～36℃、5%～10% CO2一定湿度的环境中培养。
记录放置时间。
培养18～24小时观察结果。
结果判读
观察细菌生长情况：
记录结果读取时间。
在适宜的光线下，观察对照培养皿的菌落生长情况，并对所有菌株进行初步鉴定（涂片染色和氧化酶试验）。
比较观察对照平皿和抗菌药物平皿，进行判读：接种点内有1个以上菌落或呈菌苔状为生长；接种点内无任何菌落或呈薄雾印迹为无生长。
MIC判读与记录：
MIC是指抗菌药物能够抑制细菌生长的最小抑菌药物浓度，表示单位为mg/ml 。
记录各抗菌药物浓度平皿上细菌生长情况，在《WHO参考菌株及MIC实验结果记录表》用（+）表示生长，（-）表示无生长。
每批实验结果必须由另外一名技术人员复读、签字，以确保结果的准确性。
参考菌株的判读：
本次测定的参考菌株MIC值在标准MIC值范围内或在标准MIC值±1个浓度范围内表明本次试验有效。
本次测定的参考菌株MIC值超出上述范围则表明本次试验无效，需重新配制抗菌药物
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