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PCR 引物设计 引物设计的原则 ?首先引物要跟模板紧密结合； 其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 最后引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。 引物设计需要考虑的因素 围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如： 引物长度（primer length）， 产物长度（product length）， 序列Tm值 (melting temperature)， ΔG值(internal stability)， 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）， 错误引发位点（false priming site）， 引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。 引物设计要点 一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。 引物设计要点 ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。 引物设计要点 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 关于引物的自动有哪些信誉好的足球投注网站和评价分析 推荐使用自动有哪些信誉好的足球投注网站软件： Primer Premier 5.0 推荐使用引物评价软件： Oligo 5/6 OLIGO 5.0 PCR 引物设计 （二） 分析蛋白质的二级结构 二级结构：主要是氢键维持的结构 ?－螺旋（?-helix） ?－折叠（?-sheet） 弯（turn） 2. 分析糖链连接点 糖链连接方式 O－连接：丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸的羟基 N－连接：天门冬酰氨的酰氨基 常用观看蛋白三级结构的软件 RasMol / WPDB Cn3D /Structure/CN3D/cn3d.shtml Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 四） 分析膜蛋白质 膜蛋白种类 膜镶嵌蛋白质 膜附着蛋白质 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 预测蛋白质的跨膜区 ExPASy 主页选择Post-translational modification and topology prediction 在“Topology prediction”栏目选择“SOSUI”分析工具 在SOSUI主页选择分析“SOSUI”分析软件 在SOSUI：Submit a protein sequence网页粘贴序列 分析结果 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 其它分析软件 DAS：分析原核生物蛋白质的跨膜结构 Tmpred：分析蛋白质的跨膜结构和在膜上的方向 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 20