2014级硕士研究生细胞培养与细胞操作重点..docVIP

细胞培养的概念 指从体内取出组织，细胞制成单个细胞悬液，在体外模拟体内生理环境，在无菌，适当温度和一定营养条件下，使其生存和生长，并维持其生存和生长的特性，继续存活与增值。培养过程中不在形成组织。也可用已经建系形成的细胞株（系）复苏后继续培养，多是癌细胞，其目的是进行后续的生命科学研究，如细胞操作等。 利用细胞培养技术进行生命科学研究的优点 1研究的对象是活的细胞 2研究的条件可以人为控制 3 研究的样本可以达到均一性 4 研究的内容便于观察、检测和记录 5 研究的范围比较广泛 6研究的费用相对较经济 试述影响体外培养细胞生长的各种因素。 1 无毒无污染的培养环境 离体细胞缺乏防御能力，在有污染物和毒性物质的环境中生存可造成细胞生物学特性改变，甚至中毒死亡。生物、物理及化学因素都可能入培养环境造成污染。 2 恒定的生长温度 组织和细胞培养的最适温度为35～37℃，培养细胞对低温的耐受力比对高温强 3 合适的气体环境 开放培养时一般把细胞置于95%空气加5% CO2混合气体环境中 4 pH缓冲系统 培养环境需保持pH值恒定，大多数细胞的适宜pH值为7.2～7.4。细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。一些细胞喜欢偏碱环境，如：成纤维细胞，最适pH是7.4～7.6 5 理想的渗透压 人血浆渗透压290mmol/L，是培养人体细胞的理想渗透压，鼠细胞渗透压在320mmol/L左右。细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性 6 湿度和光 开放培养相对湿度控制在95%以上 细胞培养需避光，紫外线或可见光可造成核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物，抑制细胞生长，降低其贴壁能力 7 影响细胞生长的其他因素 放射线、机械振动、接触橡胶用品、细胞接种密度的大小都会对细胞产生影响 细胞培养过程中常见的污染来源和污染类型有哪些？叙述各污染类型的特征。 污染的来源： 1 不洁净的空气：空气是扩散微生物的最主要途径 2 消毒不彻底：各种培养器皿、器械洗刷不干净和消毒不彻底 3 操作不当：实验操作无菌观念不强，消毒不严格，交叉污染 4 不洁净的组织标本：组织标本表面清理、消毒不彻底，碘酒消毒后脱碘不彻底 5 使用污染血清：血清灭菌不彻底，潜在病毒和支原体污染 污染类型： 1 支原体污染：无致死病毒，可与细菌长期共存，对细胞形态和功能的影响是潜在和持久的 2 病毒，细菌和霉菌污染：增殖迅速能在短时间内在数目上超过细胞或产生有毒物质杀死细胞 3 化学和物理性污染：化学物质混入培养液中后，有的毒性不大，被排除后，细胞仍可以继续增殖；有的化合物具有致癌性，能导致细胞发生转化。放射线，辐射污染可引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化，生长受到抑制，甚至死亡 4 交叉污染：有些变化较轻微、不易察觉；严重时，污染的细胞优势生长，培养的目的细胞生长受抑，最终死亡 5 什么是天然培养基？什么是合成培养基？为什么在合成培养基里加入血清？ 1 天然培养基有血清，血浆和组织提取液（如鸡胚，牛胚浸液）。其营养成分丰富，培养效果好，但来源受限成分复杂，易发生支原体污染。 2 合成培养基是指根据细胞生存所需物质的种类和数目，用人工方法模拟合成的。主要成份：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、缓冲体系和其它辅助物。 3 人工合成培养基只能维持细胞的生存，要想细胞生长和增值，还需添加一定量的天然培养基（如血清）。血清类型：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清，胎牛血清质量最好 6.培养细胞环境中维持5%的CO2的意义。 1 调节营养液的pH值 2 在细胞的生长过程中会产生许多代谢废物，使培养基的pH值发生改变，当积累到一定程度时就会影响细胞的生长，所以需要CO2来缓冲 3 如果没有CO2，要维持培养液的一个相对稳定、正常的pH值，就需要经常的换液，过于频繁的换液细胞不容易适应，从而也会影响细胞的生存状态 7贴壁细胞贴附和铺展的意义。 1 贴附的意义 贴附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求，细胞被接种到培养皿内以后首先要发生粘附，是细胞培养之后能否成功的第一步。需要贴附的细胞，悬浮后耽误的时间越长，越容易发生退化 2 铺展的意义 铺展状况是调节细胞形状的主要方面，铺展的越好，细胞越扁，细胞与生长基质表面接触面积越大。 铺展状况和细胞生长状况有密切的关系，铺展状况制约细胞的分裂生殖活动过程，只有当他浦站顺利到合适的程度DNA合成才开始进行。 8原代细胞的各种分离方法及其原理是什么？ 1 离心法：利用不同的离心速度，在选用悬液中某些细胞时，采用细胞分离液离心，不同比重细胞在分层液的不同层，收获目的细胞 2 机械分离法：将细胞用机械的方法分离 3 消化分离法：利用各种消化酶将组织块消化成单个细胞的方法 包括1胰蛋白酶法，其作用与赖氨酸