免疫组化-非标记免疫酶法(PAP).docxVIP

非标记抗体酶法　　由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法）。现分述如下。　　（一）酶桥法　　1．基本原理　　首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节　省第一抗体的用量。　　2．染色步骤主要程序如图4-4图4-4　酶桥法主要染色步骤　　（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。　　（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a IgG抗体）孵育1～1.5h（室温）。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。　　（3）切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育1～1.5h（室温）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。　　（4）切片与酶（HRp 70～100μg/ml,PBS溶解）孵育0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。　　（5）显色等与酶标抗体法相同。　　酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。　　（二）PAP法　　1．PAP的制备及特征　PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。　　（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10mg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[（福氏完全佐剂，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];间隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0.1mg/ml）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。　　（2）制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3），而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。　　【步骤】　　①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml）的水溶液。　　②混匀，室温1h后，离心16000g 4℃15min。　　③0.9% NaCl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 4℃15min，重复4次。　　④加15.3ml HRP水溶液（含HRP30.64mg），室温，持续搅拌。　　⑤用1N HCl及0.1N HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1N 及0.1n NaOH调pH至7.2。　　⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃45min。　　⑦离心35000g 0℃15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。　　⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP