疾病产生的分子基础-药学2014年__培训课件.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 未发生酶切 发生酶切 电泳分离 * 缺点： 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割； 分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为 70%； 需要制备特异性的RNA探针 * 2.杂合双链分析法（heteroduplex analysis, HA） 3. 化学切割错配法（Chemical cleavage of mismatch, CCM） 4.酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage) * 测序：双脱氧自动化序列分析 SSCP：单链构象多态性分析 RFLP：限制性酶切长度多态性 DNA芯片技术 AS-PCR技术 ASO杂交技术 MS-PCR DGGE等 * 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。 SAGE原理: 分离每个转录本特定位置的较短单一的序列标签（约9-11个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。 二、基因表达水平分析 * Serial analysis of gene expression (SAGE) 技术流程 反转录 酶切 连接 测序 单条测序＝＝对30－40条EST测序 分析 由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析： 基因表达量分析、寻找新基因等等 实验步骤较长要求较高 * 三、基因功能的研究 转基因技术 基因打靶 反义寡核苷酸技术 反义RNA技术 核酶技术 RNA干扰技术 基因诱导超表达技术 反义技术 * 1. 转基因技术 指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。 * 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因—— 被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) —— 目的基因的受体动物 * 转基因动物操作技术流程 获取外源目的基因 含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物 简明操作步骤 * 转基因动物实例一 超级奶牛－普通奶牛的三倍大 （英国） * just a joke * 2. 基因打靶(gene targeting) 通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。 基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代 * Marrio Capecchi于八十年代末在Utah大学发展起来。实验动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠(knockout mice)。 基因敲除技术是研究基因功能的一项非常有用的技术(遗传病研究、研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的基因作用）。 基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。 * 基因打靶的必备条件 胚胎干细胞(ES细胞) 能在体外培养，保留发育的全能性 打靶载体 Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase) * 基因敲除的基本程序 打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞：重组置换 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种 * * 美国犹他大学 Mario R. Capecchi 美国北卡罗来纳州大学 Oliver ?Smithies 英国卡迪夫大学 Martin J. Evans 2007年诺贝尔生理学或医学奖:基因打靶 * 3. 反义技术 * 核酶技术确定基因在疾病中的作用 （1） RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。 （2）优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。 （3）设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。 *