实验核医学第四章 【参考】.pptVIP

影响碘化反应因素： 1.可结合基团数量，及暴露程度； 2.氧化剂性质、反应条件(pH、浓度、温度、反应时间)。 一般来说，在保证一定标记率得前提下，尽可能减少氧化物得用量，以保证标记物得生物活性和免疫活性。 碘化反应种类： 1.氯胺-T法： 方法简便，标记率高，重复性好，试剂易得，是迄今最常用方法之一。 Cl-T（N-氯代对甲苯磺酰胺钠盐）：性质温和，在水溶液中水解产生次氯酸，次氯酸氧化碘离子成碘分子。 注意事项： ①氧化剂Cl-T不稳定，临用时配置； ②用量适当； ③反应完需用等量的还原剂偏重亚硫酸钠（Na2S2O5)中和,临用时配置； ④pH在7～8，常用0.2～0.5M磷酸缓冲液； ⑤反应体积适当，50～300μl； ⑥温度和时间，室温1～3min，若4℃，增加时间； ⑦不适用于生物活性不稳定物质，如一些补体、某些激素、酶、受体等。 2.乳过氧化物酶法（LPO）： 过氧化物酶作用于H2O2，放出新生态氧，氧化125I-为碘分子。常用乳过氧化物酶。 注意事项： ①用量少，为待标记蛋白的1％； ②pH范围较宽，4～8.5； ③H2O2用量少； ④反应时间30～60min ⑤也能用于各种脂肪、细胞、细胞膜的标记； ⑥过氧化物酶来源困难，标记率低； ⑦酶本身也可能被标记而产生杂质。 3.固相氧化法： 将氧化物或过氧化物酶以固体的形式，或制成固体颗粒，进行液-固氧化反应。 目前常用Iodogen法。 Iodogen：1,3,4,6-四氯3α,6α-二苯-甘脲，氧化剂，与Cl-T同属氯酰胺类。 注意事项： ①Iodogen不溶于水，可用二氯甲烷溶解； ②制备Iodogen涂管（5～25μg/管），封口冷藏； ③无需配置氧化剂、还原剂 ④将反应液倒出或稀释，即终止反应； ⑤对标记物损伤程度小，标记率较高。 4.联接标记法： 间接标记法。先将放射性碘标记到较活泼试剂上，再联接到待标记化合物上。 常用Bolton-Hunter试剂，3-(对-羟基苯)丙酸-N-琥珀亚胺酯（HPNS）。 步骤：①125I标记HPNS；②125I-HPNS上的酰基与蛋白质或多肽上的游离氨基发生缩合反应。 可避免蛋白质与氧化剂直接接触，防止生物活性损伤；对于在体内不稳定的酪氨酸残基碘标记物，提供一种选择。 较麻烦，引入一较大基团会影响示踪性质。 四、32P、33P和35S标记化合物的制备 32P：射线能量较强（1.7MeV），易检测，但辐射危害大，半衰期短（14d），自显影条带有扩散，分辨率低； 35S：能量较低（0.167MeV），半衰期较长(87d)，自显影条带清晰，分辨率高，无需特殊防护，自显影前需制成凝胶干胶板； 33P：能量适中（0.25MeV），半衰期为25d，自显影清晰度、分辨率适中，无需特殊防护。 制备方法：化学合成、生物合成、酶促法、同位素交换法。现一般均有商品供应。 第四节 纯化与鉴定 放射性核素检测的灵敏性，应用时的微量，都必需要求标记化合物的放射化学纯度达到一定的高度（至少大于95％），这样才能达到实验目的，结果才可靠。 杂质来源： ①未标记上的游离放射性核素； ②待标记物的不纯物被标记上放射性核素； ③贮存时，由于标记物的不稳定，或发生辐射自分解，产品性质、结构发生变化。 一、标记率的测定 常用纸层析、TLC法测定分析。 （一）原理： 样品中各组分性质不同，在固定相上的吸附能力和在流动相中的溶解度不同，随流动相的移动速度也就不同。 一般随固定相的不同，而有不同的分离效果。 （二）基本操作 1.固定相的选择 根据实验要求或标记物的性质。 2.展开剂的选择 重要因素，直接影响分离效果。根据标记物的性质差异，通过各种极性不同的溶液配伍组成展开剂，以有效分离。 3.点样与展开 样品、参考样，展开距离。 （三）结果测量 1.放射自显影 一般不用。 2.分段测量 常用手段。 3.放射性扫描 快速、简便、直观，但要求一定的活度。 （四）注意事项 1.分离条件要确保各组分有效分离。 2.高比活度样品需加适量载体，防止吸附。 3.放射性浓度低时，可重复点样。 二、分离纯化 层析法──纸层析、薄板层析、柱层析 透析法、电泳法 一般与标记率测定的分离方法一样，根据标记物性质选择固定相、流动相。 三、