体内药物分析-第一章 1【参考】.pptVIP

* ⑵萃取条件的选择 ①药物等组份自蒸馏水中的萃取试验 ②药物等组份自血浆中的萃取实验 ③标准曲线的建立与样品测定 * 二、定量分析方法验证 1.特异性(specificity) 2.标准曲线与线性范围（calibration curve and linear range） 3.精密度与准确度(precision and accuracy) 4.检测限和定量限 * 5.样品的稳定性（stability） 6.提取回收率(extraction recovery) 7.定量对照样品 * 下面介绍一种药物的体内分析方法及方法验证情况。 一种高效液相色谱法测定老鼠血浆和组织中刺五加苷E和刺五加苷B含量 色谱分析在Kromasil C18柱上完成，以水-乙睛为流动相梯度洗脱，流速为0.8ml／min，刺五加苷E和刺五加苷B的检测波长分别为220nm和206nm，乙睛沉淀蛋白，用乙睛从生物样品中提取刺五加苷E和刺五加苷B，固相萃取分离样品，用60%甲醇溶液洗脱。 * 刺五加苷E和刺五加苷B的提取回收率分别为91.2%和88.8%。血浆中刺五加苷E和刺五加苷B的 的LOD分别为37.6ng/ml和37.0ng/ml（S/N=3）。刺五加注射液股静脉给Wister 大鼠后，血药-时间曲线符合三室模型，刺五加苷E在肝中药物浓度最大，心脏中药物浓度最小；刺五加苷B在肾中药物浓度最大，心脏中药物浓度最小。固相萃取制备样品简单、快速、精确。该方法用于刺五加苷E和刺五加苷B的药代动力学研究准确、可靠。色谱图见图4-6。 * 色谱图（a）对照血浆；（b）注射刺五加注射液15min后大鼠血浆； (c)对照肾组； (d)注射刺五加注射液30min后的大鼠肾组织 * SPE 的方法建立 3．1 选择SPE小柱或滤膜首先应根据待测物的理化性质和样品基质，选择对待测物有较强保留能力的固定相。若待测物带负电荷，可用阴离子交换填料，反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物，可用反相填料萃取。SPE小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的体内样品，一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。 3．2 活化 萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用5～10 ml溶剂冲洗滤膜。一般可先用甲醇等水溶性有机溶剂冲洗填料，因为甲醇能润湿吸附剂表面，并渗透到非极性的硅胶键合相中，使硅胶更容易被水润湿，之后再加入水或缓冲液冲洗。加样前，应使SPE填料保持湿润，如果填料干燥会降低样品保留值；而各小柱的干燥程度不一，则会影响回收率的重现性。 * 3．3 加样一般可采取以下措施：(1)用0．1 mol／L酸或碱调节，使pH3或pH 9，离心取上层液萃取；(2)用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液，以水或缓冲液稀释后萃取；(3)用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液，调节pH值后萃取；(4)超声15 min后加入水、缓冲液，取上清液萃取。尿液样品中的药物浓度较高，加样前先用水或缓冲液稀释，必要时可用酸、碱水解反应破坏药物与蛋白质的结合，然后萃取。流速应控制为2～4 ml／min，流速快不利于待测物与固定相结合。 * 3．4 清洗填料 反相SPE 的清洗溶剂多为水或缓冲液，可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐或调节pH值。加入小柱的清洗液应不超过一个小柱的容积，而SPE滤膜为5～10 ml。 3．5 洗脱待测物 应选用5～10 ml离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。若需较高灵敏度，则可先将洗脱液挥干后，再用流动相溶解残留物后进样。能力较弱的SPE填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物，再用极性较强的HPLC分析柱 柱分析洗脱物。若待测物可电离，可调节pH值，抑制样品离子化，以增强待测物在反相SPE填料中的保留，洗脱时调节pH值使其离子化并用较弱的溶剂洗脱，收集洗脱液后再调节pH值使其在HPLC分析中达到最佳分离效果。在洗脱过程中应减慢流速，用两次小体积洗脱代替一次大体积洗脱，回收率更高。 * 固相微萃取 固相微萃取可用于气相色谱，也可用于液相色谱。用于GC时．是将固相微萃取针管(不锈钢套管)插入进样口，使用进样口的高温热解吸目标化合物，解吸后被载气带入色谱柱。们于HPLC时，是将固相微萃取针管(不锈钢套管)插入固相微萃取41PLc接口解吸池，然后再利用HPLC的流动相通过解吸池洗脱目标化合物，并将目标化合物带入色谱柱。 * 3 关于结合物的水解问题 所谓体内的结合物是指药物进入体内，有的以原型，有的经氧化、还原、水解后生成的代谢产物与体内的葡萄糖醛酸、醋酸、硫酸等结合而生成的化合物．由于它们较原型的药物具有较大的极性，不易被有机溶剂所提取，所以常需要通过水解将药物游离后，再用有机溶剂进行提取、分离和测定． 对于体内结合物的水解，