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基因组学 1. 简述基因组的概念和其对生命科学的影响。 基因组：指一个物种的全套染色体和基因。广义的基因组： 核基因组，线粒体基因组，叶绿体基因组等。 基因组计划对生命科学的影响： 研究策略的高通量，彻底认识生命规律 ：基因组研究高通量 ，研究手段和研究策略的更新 ，加强了生命科学研究的分工与协作 ，从不同层次深入研究生命现象。 促进了相关学科的发展：分子生物学 遗传学 生物信息学 生物化学 细胞生物学 生理学 表观遗传学等 物种的起源与进化： Ⅰ.重要基因的发掘、分离和利用：遗传疾病相关基因，控制衰老的基因，工业价值的细菌基因，重要农艺性状基因等。基因的表达、调控，基因间的相互作用， 伦理学法律问题：伦理问题，知识产权问题，法律问题，社会保险问题。 反向遗传学研究指从基因序列开始的遗传学研究，关心的问题是基因功能丧失后会使植物的表型产生什么样的变化。 4. 分子标记，构建遗传图谱，原理，步骤 遗传作图的遗传学原理：主要依据经典孟德尔遗传学的连锁和交换定律。减数分裂时，同源染色体彼此靠拢，同源区段并排形成双联体。在双联体中，并列的染色体臂在等价的位置发生DNA交换的频率与在染色体上所间隔的距离成正比，重组率则可成为衡量基因之间相对距离的尺度。通过重组率可判断基因在染色体上的相对位置，从而绘制遗传图。 步骤：选择适合作图的DNA标记 根据遗传材料之间的DNA多态性，选择 用于建立作图群体的亲本组合 建立分离群体 测定群体中不同个体的标记基因型 对标记基因型数据进行连锁分析，构建 标记连锁图 显性标记：仅能检测显性等位基因，不能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记。 同时能检测出显性和隐性等位基因，能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记。cDNA文库，其主要目的是减少测序量，尽量获得更多基因尤其是低转录基因的信息。 基因组中绝大多数基因属于中等或低表达丰度 保留了表达丰度低的基因信息 原理相关：1）基于复性动力学原理：高丰度的cDNA在退火条件下复性速度快，而低丰度的cDNA复性需要较长时间，通过控制复性时间来降低丰度。 2）基因组DNA饱和杂交:基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA与基因组DNA饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。 6. 非编码RNA, miRNA, siRNA miRNA产生机制：动物细胞中，miRNA首先在细胞核内转录出较长的初级miRNApri-miRNA），然后在核内由Drosha加工成60~70个核苷酸的发夹状RNA，即前体miRNA（pre-miRNA），在Exprotin-5复合物的帮助下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为成熟miRNA，随即被整合进RNA沉默复合物（RISC）中，基于与mRNA完全或不完全配对来调节基因表达。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体（RISC）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。2kb左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。 第二，高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序，TIGR在完成流感嗜血杆菌的基因组时，使用了14台测序仪，用三个月时间完成了必需的28,463个测序反应，测序总长度达6倍基因组。 第三，序列集合。TIGR发展了新的软件，修改了序列集合规则以最大限度地排除错误的连锁匹配。 第四，填补缺口。对某基因组文库全部克隆片段进行末端序列测定中未测到的碱基数，即缺(gap)。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未测序的序列缺口。他们建立了插入片段为15-20kb的λ文库以备缺口填补。 鸟枪法测序的缺点： 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，各个片段重叠或一个连续体的概率是2n2-2n。高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。 对鸟枪法的改进: (1) Clone contig法。首先用稀有内切