有哪些信誉好的足球投注网站- 1、有哪些信誉好的足球投注网站（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
实验五 DNA片段的体外连接 一、实验目的 学会DNA的体外连接技术。用T4 DNA连接酶将实验四中已回收的目的基因片段与相应的载体DNA片段（用相同的酶切，含匹配的粘性末端）连接起来，构建体外重组DNA分子。 二、实验原理 体外重组DNA分子是在T4 DNA连接酶的作用下、在含Mg2+、ATP等的连接缓冲液系统中，带有匹配末端的两个DNA片段连接而成的。 DNA连接酶的作用步骤： ① T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-TMP复合物（腺苷酰酶）。 ②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA片段上，使DNA腺苷化。 ③产生一个新的磷酸二酯键，并把缺口封起来。 通过控制载体DNA与目的DNA的分子比例等来影响重组率。 一般情况下，载体DNA的摩尔数与目的基因片段的摩尔数之比为1比5；目的基因片段的比例太大，容易产生基因自连后插入载体的多聚体。连接体积太大自连机会也会增多。 （三）连接反应的条件 1、缓冲液：一般都配成5~10倍的缓冲液。缓冲液中含有Mg2+、ATP作为辅助因子以为连接反应提供能量，同时也含有一些保护和稳定连接酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）可以防止酶氧化失活，BSA（小牛血清白蛋白）可使连接反应中维持有一定浓度的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低而使酶变性失活。 2、温度：在37℃时有利于连接酶活性的发挥，但在这一温度下结合的粘性末端氢键是不稳定的，而且连接酶的活力也不能保持太久。因此，在实际操作时，折中采用催化反应与末端粘合相一致的温度，即12-16℃左右为宜，也可较温度如4℃下连接，但连接时间要延长。 三、实验材料 离心机、移液器 回收纯化的DNA样品（Rv1791基因） T4 DNA连接酶及其附带的缓冲液 连接体系： 回收DNA片段 6ul pCR2.1 2ul 10×连接buffer 1ul T4 DNA连接酶 1ul Total 10ul 连接条件 ： 16℃金属浴连接过夜 五.思考题 DNA的连接方式有哪些?
文档评论（0）