七叶亭对巨噬细胞株TNF―α、IL―6和NF―κB影响的实验研究.docVIP

七叶亭对巨噬细胞株TNF―α、IL―6和NF―κB影响的实验研究 　　【摘 要】目的：探索七叶亭（Esculetin）对巨噬细胞株RAW264.7细胞活性及分泌炎性因子TNF-α、IL-6和NF-κB表达的影响。方法：分别加入12.5、25、50μM的Esculetin与巨噬细胞RAW264.7共培养24h后，MTT观察不同浓度Esculetin对细胞活力的影响； ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6含量；Western blot检测NF-κB的表达。结果：不同浓度的Esculetin对RAW264.7活力无明显影响；不同浓度的Esculetin可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6，浓度越高，抑制作用越强；Esculetin抑制NF-κB蛋白的活化作用随浓度变化而不同，25μM和50μM对NF-κB活化的抑制作用最强。结论： Esculetin对巨噬细胞株RAW264.7的活力无明显影响；Esculetin能抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌，并呈剂量依赖关系；能抑制NF-κB蛋白的活化。其发挥抗炎作用有可能是依赖NF-κB信号通路而完成的。 　　【关键词】七叶亭；巨噬细胞；TNF-α；IL-6；NF-κB 　　【中图分类号】R 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0013-03 　　动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）是缺血性心脑血管病的病理基础，心脑血管病发病率与死亡率近年也明显增加。AS具有慢性炎症反应特征的病理过程[1]，而且AS从粥样硬化斑块形成到斑块破裂，导致血栓形成的各个阶段，都有炎症细胞和炎症介质参与。本研究用七叶亭（Esculetin）作用于巨噬细胞 RAW264.7，观察巨噬细胞活性、分泌TNF-α、IL-6以及对NF-κB活化的影响，探讨七叶亭抑制炎症反应-抗动脉粥样硬化的可能机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海细胞生物学研究所 　　1.2 实验试剂 七叶亭（ Alfa公司），MTT （ Sigma公司 ），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），DMEM培养基（南京凯基生物工程有限公司），小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p-p65抗体（Cell signaling公司），β-actin蛋白多克隆一抗，山羊抗兔二抗，马抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。 　　1.3 主要仪器与设备 　　低温高速离心机（中国科大创新股份有限公司），电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂），Olympus荧光倒置显微镜（日本Olympus公司），酶标仪Bio-Rad 550（美国伯乐公司），微型高速离心机（珠江黑马医学仪器有限公司），-80℃超低温冰箱、超净工作台（美国Forma公司），CO2培养箱（香港力康Heal force公司），微量加液器（芬兰Biohit公司）。 　　1.4 实验方法 　　1.4.1 细胞活性的 MTT检测 　　（1）接种细胞：用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液将培养的第3代RAW264.7细胞从细胞培养瓶壁消化下来，再用含10%胎牛血清培养基配成单细胞悬液，调细胞密度2.5×104个/mL，每孔200μL，接种在96孔板中；（2）实验分组：空白对照组，Esculetin12.5μM，Esculetin25μM，Esculetin50μM（见表1）。每组设4个复孔；（3）细胞培养：37℃、5% CO2条件下培养，24h后换无血清DMEM培养液，继续孵育24 h后加入药物干预24h；（4）呈色：分别于药物作用结束前4h，每孔加5mg?mL- 1 MTT 20μL，4h后终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min使结晶充分溶解；（5）比色：在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度。 　　1.4.2 巨噬细胞 RAW264.7分泌TNF-α、IL-6的检测 　　用含10%胎牛血清培养基培养RAW264.7细胞，细胞长满瓶底80%时，弃去培养基，加PBS液漂洗 2次；加入含胰酶和EDTA的消化液1-2ml，37℃消化约2min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化；弃消化液加PBS液漂洗 2次，加入新培养液10 ml，反复吹打混悬细胞，细胞密度调整为1×55/ml；以每孔 1ml细胞悬液将细胞接种到6孔板，每孔再加培养基4ml；然后将6孔板放入 5%CO2孵箱37℃培养24h，待细胞长满瓶底80%时（见图1），弃去上清液，分别加入终浓度为0（空白对照），12.5μM，25μM，50μM的含药培养基DMEM， 继续培养24h。收集每孔培养基2ml，1000r