运用血清蛋白质组分析方法筛选乳腺浸润性导管癌相关抗原.docVIP

运用血清蛋白质组分析方法筛选乳腺浸润性导管癌相关抗原 　　【摘要】目的：筛选乳腺浸润性导管癌相关抗原（TAA），为研究乳腺癌的发生、发展机制及防治方案提供依据。方法：体外培养人乳腺浸润性导管癌细胞株T-47D并提取总蛋白，取T-47D细胞总蛋白经双向电泳技术（2-DE）分离后转膜，分别用20例健康人（N组）血清和20例乳腺浸润性导管癌患者（乳腺癌组）血清作为一抗进行Western blot分析，找出差异蛋白、经胰酶酶解后进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定。结果：筛选出10个差异蛋白，经LC-MS/MS鉴定为热休克蛋白90、脯氨酰-4-羟化酶β亚基、内质网-60蛋白酶、热休克蛋白60、未命名蛋白、人类真核翻译延伸因子1γ、假想蛋白、热休克蛋白27、磷酸甘油酸变位酶1和核糖体蛋白P0。结论：本研究发现了10个可能的乳腺浸润性导管癌TAA，此为进一步研究乳腺癌的发生、发展机制及防治方案提供了一定的实验基础。 　　【关键词】乳腺浸润性导管癌；双向电泳；血清蛋白质组分析；相关抗原 　　【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）04-0144-02 　　贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目（2005-298）；贵州省科学技术基金项目（黔科合J字2007-2086） 　　乳腺浸润性导管癌是乳腺癌中最常见的一种类型，预后较差[1]。肿瘤相关抗原（TAA）是在肿瘤发生、发展过程中高表达的，能够诱发机体发生免疫应答的抗原。血清学蛋白质组分析（SERPA）是一种基于蛋白质组学和免疫学原理，利用二维电泳和质谱分析方法筛选和鉴定TAA的新技术[2]，目前已被广泛应用于肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病的研究中[3]，但其在乳腺浸润性导管癌研究中应用的报道尚少。我们采用SERPA方法对乳腺浸润性导管癌TAA进行了筛选，以期为该病的发生、发展机制研究及辅助诊断提供基础。 　　1材料 　　1.1标本来源 　　收集贵阳医学院附属医院2010年12月至2011年3月期间收治的20例女性乳腺浸润性导管癌患者（无其它自身免疫性疾病）的静脉血清作为实验组，所有病例取材得知情同意，采血和手术前未进行放疗、化疗和内分泌治疗，年龄范围34-78岁，平均年龄49.5岁；所有患者组织标本均经病理结果证实，按国际抗癌协会（UICC）制定的乳腺癌分期标准（TNM分期法）分为Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期7例。另外同期采集20例健康女性志愿者静脉血清作为对照组，年龄范围36-75岁，平均年龄52.8岁。健康志愿者均经系统健康体检，无乳腺相关疾病史、其它自身免疫性疾病和恶性肿瘤家族史。人乳腺浸润性导管癌细胞株T-47D细胞购自中国科学院细胞库。纳入本研究者采其空腹静脉血5ml，尽快分离血清并置-80℃冰箱保存。 　　1.2主要试剂 　　高糖DMEM培养基购于美国Gibco公司；IPG胶条（13cm，pH3-10）、裂解液购自Amershan biosciences公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG（HRP-兔抗人IgG）购自武汉博士德公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自美国Millpore公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养及总蛋白的制备 　　用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于5%CO2细胞培养箱中培养。收集对数生长期的细胞，加入5倍体积裂解液（7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，65mM DTT，0.2%Bio-Lyte）混匀，液氮中反复冻融3-4次（每次置液氮中3秒，室温融化），加入20ug/ml脱氧核糖核酸酶，离心1小时（4℃，20000×g），取上清即为细胞总蛋白。用Bradford法检测浓度，将样品分装并且置-80℃保存。 　　2.2 双向电泳和Western blot分析 　　取700μg T-47D全细胞蛋白进行2-DE，2-DE操作按照说明书进行。2-DE所得凝胶经考马斯亮蓝R-250染色液染色2h；并脱色至蛋白点清晰可见为止。 　　T-47D细胞总蛋白经双向电泳分离后，半干转印法转印至PVDF膜并封闭2h，分别与1：100稀释的乳腺浸润性导管癌或对照血清（一抗）于室温孵育2h，用TBST洗膜液洗膜（10min×3次）；其次与辣根过氧化物酶标记的兔抗人（1：3000）二抗室温孵育2h；再经TBST溶液洗膜（10min×3次）；最后经ECL化学发光检测得到胶片；观察杂交信号点，并确定发生免疫反应的蛋白在双向电泳凝胶上的位置。 　　2.3 统计学处理 　　采用SPSS17.0统计软件，用X2检验对与患者血清和对照血清发生免疫反应的蛋白进行分析，p0.05为差异有统计学意义。 　　2.4候选蛋白酶解和质谱鉴定 　　选取2