第二章 基因工程工具酶(简化版)课件.ppt

一、限制性核酸内切酶的发现 核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的3,5磷酸二酯键 核糖核酸酶（RNase）： 脱氧核糖核酸酶（DNase）： 核酸外切酶（exonuclease）： 核酸内切酶（endonuclease）： 平末端 粘性末端 1单位酶活性(1unit 1U)：在最适反应条件下1小时完全切割1ugλDNA样品的酶量。 同序同裂酶(识别及酶切位点相同): 同序异裂酶(识别位点相同但酶切位点不同): 同尾酶(酶切位点不同但产生相同的粘性末端): 酶切位点的计算： 四核苷酸识别序列：44 = 256 六核苷酸识别序列：46 = 4096 2个假设：a 随机排列；b GC含量50% 如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）: 理论上的切点数： 49000/4096=12个 实际情况？ 三、限制性核酸内切酶的命名 1973年H.Smith和D.Nathans提议 ①每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代表： 第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写； 第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母； 　　　如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，代表从大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。 ②第四个字母表示菌株的类型（大小写均有），如EcoR中的R代表大肠杆菌R株。 ③如果一个菌株有几种限制酶，则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。 思考题： 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）d菌株有三种限制酶，分别怎么表示？ 一、天然DNA的制备 1、天然DNA的来源 ①染色体DNA ②病毒和噬菌体DNA ③质粒DNA ④线粒体和叶绿体DNA 2、天然DNA的提取 ①准备生物材料。 ②裂解细胞。 ③分离和抽提DNA。 二、DNA的纯化 琼脂糖凝胶电泳洗脱法 适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收。 三、 DNA的浓缩 乙醇沉淀法 在含一价阳离子的DNA溶液中加入2体积的无水乙醇，使DNA沉淀（-20℃，时间在30min以上） 通过离心收集沉淀的DNA 溶于适量的TE缓冲液或无菌水中 四、限制性核酸内切酶反应 1、限制性核酸内切酶反应缓冲液 2、单酶切法 若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同 若DNA样品本来就是线形 DNA片段，完全酶切的结果，产生n＋ 1个 DNA片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端 3、双酶切法 应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割，然后调节缓冲液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。 如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同，则应先用最适反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进行切割。 若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大，会明显影响双酶切结果，则可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需要的DNA片段，再选用合适的反应系统，进行第二种限制性核酸内切酶的切割。 4、部分酶切 当某种限制性核酸内切酶在待切割的DNA分子上有多个识别序列，并且其中一个识别序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，势必将此待用的DNA片段从中切断。在此情况下，对DNA样品进行部分酶切，经过凝胶电泳，根据待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段 5、DNA分子的限制性图谱 五 、影响核酸内切限制酶活性的因素 （1）DNA的纯度 （2）DNA的甲基化程度 （3）酶切消化反应的温度 （4）DNA的分子结构 （5）星星活性 一、DNA聚合酶概述 DNA聚合酶（polymerase）： 以DNA或RNA为模板催化合成互补新链的酶。大多需要一个引物来起始互补新链的合成。  间断(discontinuity)：在DNA的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。 （1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型”（2）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性（3）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板 二、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶） 1、性质: ①5’→3’ DNA聚合酶活性 ②3’→5’外切核酸酶活性 ③5’→3’外切核酸酶活性 三、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） 1、性质 它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性. 四、T4噬菌体DNA聚合酶 1、性质 具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活