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实验六SDS电泳 武汉生物医学研究院 2013年4月3日 实 验 目 的 学习SDS电泳的基本原理 掌握垂直板电泳的操作方法 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定 SDS电泳的基本原理 SDS电泳的基本原理 SDS电泳的基本原理 SDS电泳的基本原理 SDS电泳的基本原理 SDS电泳的基本原理 SDS电泳的基本原理 垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管 滤纸 微量注射器 大培养皿 (1)制分离胶：按所需的浓度配制15％分离胶。 TEMED最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置灌入，注意不能有气泡； 灌完分离胶后在胶面上小心加1毫升水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）。 (2)制浓缩胶：按所需的浓度配制5％浓缩胶。 蛋白质分子量测定 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 请大家批评指正 武 汉 生 物 医 学 研 究 院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES 武 汉 生 物 医 学 研 究 院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES 武汉生物医学研究院 Wuhan Institutes of Biomedical Sciences 武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES 武汉生物医学研究院 电泳:带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相 反的电极移动，称为电泳。 正极 负极 带负电粒子 带正电粒子 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电 泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合 而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋 白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因素 。 如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠 （缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质- SDS复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中 的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电 泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。 Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。 化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。 采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。 SDS电泳的基本原理 1. 材料： 前期实验中提取的蛋白 2．试剂： (1) 30%丙烯酰胺(Acr)：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水至100ml， 过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 (2) 10%SDS(十二烷基磺酸钠) (3) 1.5mol/l pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/l盐酸调 pH8.8，最后用蒸馏 水定容至100ml。 (4) 1.0mol/lpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/l盐酸调 pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。 (5) 0.05mol/lpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/l盐酸调 pH8.0，蒸馏水定容至100ml。 SDS电泳的基本原理 (6) 10%过硫酸铵(AP) (7) TEMED(四甲基乙二胺) (8) 上样缓冲液：SDS(100mg)+巯基乙醇(0.1ml)+ 溴酚蓝(2mg)+ 甘油(2g) +0.05mol/L pH8.0Tris-HCl(2m