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环境微生物实验问题与答案 一、光学显微镜的操作及细菌单染色 1、为什么油镜的放大倍数比普通物镜大？ 答：油镜能减少光的折射，进而提高视野的亮度；通过提高显微镜的数值口径增加显微镜的分辨力。 2、数值口径的表达公式？ 答案：N.A=n ×sin α，n为介质折射率；α为光线最大入射角的半数。 3、显微镜数值口径与分辨力的关系？ 答案：分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力，它与光的波长成反比，与数值口径成正比。 4、油镜的使用与普通物镜有何不同？ 答案：油镜必须借助于光折射率等于或接近于玻璃的试剂，如香柏油等才能使用，而普通物镜则不需要；油镜是由100×物镜与香柏油构成，而普通物镜则限于10×物镜、40×物镜等。 5、使用油镜时应特别注意什么？ 答案：上下调节镜头时应使用微螺旋，否则容易损坏镜头；应使油镜始终浸泡在香柏油中，否则就不是油镜；使用完毕后，必须用搽镜纸沾取二甲苯等有机溶剂搽去残留的油迹，否则会玷污油镜。 6、单染色的原理是什么？ 答案：主要基于微生物细胞能与各种染料进行不同程度地结合。 7、单染色过程中，为什么干燥固定？ 答案：因为通过干燥可以使菌体蛋白变性，细胞质凝固，进而可以使菌体紧密地附着于载玻片表面。 8、单染色过程中，为什么水洗时水流要缓慢地从载玻片上端流下？ 答案：因为如果水流直接冲洗有菌部位，容易使菌体被冲洗掉。 9、为什么载玻片要完全干燥后，才能使用油镜？ 答案：因为香柏油与水不相溶，容易造成光线发生折射或散射，一方面无法构成油镜，另一方面也会降低视野的亮度。 二、放线菌形态观察与细菌革兰氏染色 1、革兰氏染色的原理是什么？ 答案：对于G+细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量高，网孔小，再加上脂量低，所以乙醇脱色后，进一步地缩小了网孔，结晶紫-碘复合物无法脱出，第二次用番红染色时无法着色，进而呈紫色；对于G-细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量低，网孔大，再加上脂量高，所以乙醇脱色后，进一步地扩大了网孔，结晶紫-碘复合物被脱出，第二次用番红染色时着色，进而呈红色。 2、革兰氏染色时，为什么要加碘液？ 答案：碘可以与结晶紫染料形成较大的复合物，从而可以阻止结晶紫向细胞外渗透；另一方面也可以增加结晶紫与细胞质的亲和力。 3、革兰氏染色时，为什么要用酒精冲洗？ 答案：加酒精是为了溶解细胞壁中的脂类和脱去细胞内的有机染料。 4、革兰氏染色时，为什么不能涂片太厚？ 答案：涂片太厚，容易使菌体重叠，造成假阳性。 5、革兰氏染色时，为什么说脱色是最关键的一步？ 答案：如果脱色时间较短，则容易使革兰氏阴性细菌脱色不完全，造成假阳性；如果脱色时间较长，则容易使革兰氏阳性细菌内的染料被脱出，造成假阴性。 6、革兰氏染色时，如何证明你的染色操作是正确的？ 答案：将革兰氏阳性细菌—葡萄球菌与革兰氏阴性细菌--大肠杆菌制成混合涂片，经革兰氏染色后，如果葡萄球菌呈紫色，而大肠杆菌呈红色，则说明染色操作是正确的。 三、无菌操作（补充） 1、无菌操作过程中，为什么试管或三角烧瓶在开塞或回塞之前，口部要过火几次？ 答案：这样可以烧去管口或瓶口的微生物。 2、开塞后的试管或三角烧瓶口部微生物要平放？ 答案：如果口部向上或朝下，则容易通过空气对流污染培养物。 3、接种针接种前后微什么要过火焚烧？ 答案：主要防止微生物培养物之间交叉污染，也防止污染操作台面。 四、 细菌的芽孢与荚膜染色 1、芽孢和荚膜染色的原理是什么？用单染色可以看到芽孢吗？为什么？ 答案：根据细菌的芽孢与菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行着色，使菌体与芽孢呈不同颜色，便于观察。由于芽孢壁厚，不易着色，所以在染色时需加热，以便染料进入菌体。荚膜主要成分是多糖，很难着色，因而只能采用衬托的方法将背景与菌体染色，而衬托出白色而透明的荚膜。 用单染色也可以看到芽孢，因为单染色时，仅有菌体被染色，而芽孢不被着色，因此可以看到细菌细胞内白色的芽孢形态。 2、细菌荚膜染色时为什么不能加热？ 答案：由于荚膜属于胶质状、粘液状物质，如果加热可使荚膜失水，导致无法看到荚膜的具体形态。 3、如何用墨汁浸透法观察细菌荚膜？ 1）、取干净的普通载玻片，并在载玻片的一端滴加蒸馏水，将巨大芽孢杆菌轻沾于水滴中。 2）、加少许墨汁于菌滴中，加盖玻片，轻轻挤压，除去多余的液体。 3）、镜检，可以观察到菌体周围的白色荚膜。 4、荚膜染色时，为什么荚膜不易着色？ 答案：因为荚膜的主要成分为多糖，而多糖分子表面的电荷多为中性，很难被染料着色。 5、芽孢染色属于哪种类型？其染色过程如何？ 答案：芽孢染色过程前后共使用两种染料，所以属于复染，其染色过程为： 1）、在干净的普通载玻片一端加一滴蒸馏水，无菌操取菌，涂片、干燥。 2）、加孔雀绿染液，加热产生蒸汽，并保持蒸汽4-5min，注意不要使染