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湖南永州职业技术学院 授课课时计划 教案编号：实训16 授课章节名称 实训十六 猪瘟的诊断方法与防制 授课教师 于桂阳 教研室主任 实训目的 通过实训，使学生掌握猪瘟琼脂扩散沉淀试验和猪瘟荧光抗体检查法的操作方法。 实训重点 实训难点 教学资源 多媒体 模型 标本 √实物 √音像 其它 教材和参考书 授课班次 授课日期 教学安排 课型（2课时）： 理论 √实验 见习 其它 教学方式： 讲授 √讨论 √指导 √示教 其它 复习思考题 实施情况及分析 教学内容： 实训十六 猪瘟的诊断方法与防制 一、实训目的 通过实训，使学生掌握猪瘟琼脂扩散沉淀试验和猪瘟荧光抗体检查法的操作方法。 二、实训条件与用具 1.材料 0.01MpH7.2PBS溶液、封固用缓冲甘油、琼脂、0.01%硫柳汞、打孔器、已知抗猪瘟血清，青霉素，链霉素，生理盐水,猪瘟兔化弱毒苗,70%酒精棉球，疑似猪瘟的病猪或疑似猪瘟新鲜病料等。 2.用具 煮沸消毒锅,染色缸,注射器(1ml,5～10ml),注射针头,体温计,灭菌乳钵,剪刀,镊子,等，纱布、平皿、温箱、盖玻片、载玻片、荧光显微镜。 三、实验方法和手段 按ＧＢ猪瘟的实验室诊断方法进行操作。 四、实训内容 （一）猪瘟琼脂扩散沉淀试验 1.取病猪脾、淋巴结或其它材料，作成1：2乳液，冻融3次，离心，取上清液作抗原。 2.用生理盐水或PH7.2PBS或PH8.0巴比妥冲液制备1%琼脂。加0.01%硫柳汞或0.5%石炭酸防腐。 3.将溶化的琼脂分装于二重皿内，每皿约3毫升，琼脂层约3毫米；凝结成平板后，用孔径7毫米的打孔器打孔，每皿7个，中央1个，周围6个，孔与孔之间相距4毫米。 4.中央孔注入已知抗猪瘟血清，周围1、3孔注入已知猪瘟病毒，6孔注入正常猪血清，2、4、5孔都用病理材料清液。 5.将二重皿置密闭盒内，盒内放一块湿水的纱布，以维持湿度，置室温内。 6.每天检查2次，至第72小时止。注意各孔之间是否出现沉淀线，出现的为阳性反应，不出现的为阴性。 7.中央孔与周围的1、3孔应呈阳性反应，6孔与1、5孔应为阴性。中央孔与周围2、4、5孔如呈阳性反应，则为猪瘟；如呈阴性反应，则不是猪瘟。 （二）猪瘟荧光抗体检查法 1.标本的制备 ①猪扁桃体冰冻切片标本：将新鲜的待检扁桃体，先切成适当的小块，直接贴在冰冻切片机的冷台上（已致冷的），在-20～-25℃条件下，切成4μm薄片，贴在载玻片上，立即使其迅速干燥，（可用电风扇吹干），浸入的纯丙酮 教学过程 中在4℃冰箱内固定15分钟，取出风干，染色、镜检。或暂时密封保存在-20℃的条件下待检。 ②组织培养标本：将待检的猪瘟病毒接种于加有盖玻片的猪肾细胞组织培养小瓶内，经24～48小时后，取出盖玻片，在-20℃的条件下待检。 2.染色方法 ①荧光抗体要用0.1%伊文思兰（用0.01MpH7.2PBS稀释）按要求倍数稀释。 ②将稀释好的荧光抗体，滴加到已固定、干燥的标本片上，使其均匀薄薄的一层，静置于37℃恒温，恒温条件下（可放在加盖的盛水盒里，置温箱中）染色45分钟，用0.01MpH7.2PBS充分漂洗，分别在2分钟、5分钟、8分钟更换PBS，最后用无离子水轻轻冲洗，风干。 3.封固 滴加缓冲甘油于标本上，加盖玻片封固。 4.镜检 用荧光显微镜，或用荧光光源装置配以较好的生物显微镜，100～200倍下检查。 5.判定 猪瘟阳性：细胞的胞浆内可见猪瘟的特异荧光。高倍放大时细胞核呈暗褐色园形或椭园形，细胞质呈明亮的黄绿色。在扁桃体腺窝（隐窝）上皮细胞内可见明显的特异荧光，腺窝的横断面上皮细胞部分呈明亮的黄绿色，腺腔呈红色。淋巴滤泡中可见多量呈明亮荧光的细胞。 猪瘟阴性：全部细胞胞浆见不到猪瘟特异荧光。 五、实训报告 根据实际操作情况写出详细操作过程及试验结果。  永州职业技术学院教案纸 《养猪与猪病防治》教案