碱性磷酸酶米氏常数的测定-3学时课件.pptVIP

碱性磷酸酶米氏常数的测定 浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室 [原理] 酶催化底物发生反应时，受多种因素影响，环境的温度、pH和酶的浓度等等，在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系如下图。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(Vmax)， （一）?? Km值测定的意义 1.当反应速度为最大速度一半时，Vm = 1/2 Vmax，Km = [S] Km是指底物的浓度，含义：Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 2. Km值可表示酶对底物的亲和力。 Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需要很高的 底物浓度便可容易地达到最大反应速度。 3.Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境相关，与酶的浓度无关。 各种酶的Km值范围很广。大多数酶在0.01-100mmol/L间；对于同一底物，不同的酶有不同的Km值；多底物反应的酶对于不同底物也有不同的Km值。 思考题：1. Km值的意义是什么？ * * [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定原理、方法及意义。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = Vmax[S]/(Km+[S]) 上式中Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= Vmax/2时，Km =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此Km的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度Vmax实际上不易准确测定，Km值也就不易准确测出。林-贝 (Lineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （Km +[S]）/ Vmax[S]或1/V = Km/ Vmax·（1/[S]）+1/ Vmax 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以正确求得该酶的Km值，如图所示。 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的反应速度，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其Km值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。吸光度的大小可以表示反应速度的大小。反应式如下： 三、[试剂与器材] 1．0.04mol/L 基质液 2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 3．碱性溶液 4．0.5％铁氰化钾 5．0.3％ 4-氨基安替比林 6．37℃恒温水浴锅 7．可见光分光光度计 四、[操作步骤] 1. 底物浓度对酶促反应速度的影响 (2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴中准确保温15分钟。 (3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。 (4)各管分别加入0.3％ 4-氨基安替比林1.0mL，0.5％ 铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定。 (5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度的倒数作为1/V作纵坐标，作图求出Km值。 [结果与计算] 1.记录各管吸光度（A） 2.列表：吸光度、1/A、1/[S] 3.作双倒数图，由图得出Km值。 * * *