土壤酶实验方法.docVIP

土壤呼吸 称取20克鲜土样，放在容积为500毫升三角瓶中，塞紧瓶塞，分别放在温度为28度的条件下，培养时间分别为24小时，取出采用气象色谱法测定呼吸产生的二氧化碳和氧化亚氮浓度，计算产气量。需要设一个空瓶塞紧塞子做对照。 土壤微生物量碳试验 分对照组和氯仿熏蒸组（熏蒸时间为24小时），对照组12个熏蒸组12个 氯仿熏蒸24小时，对照组不熏蒸 对照组：称取土壤鲜样25克于250毫升三角瓶，然后加入0.5M 硫酸钾（87.1克溶于1升去离子水）80毫升，封口膜封住瓶口，摇床震荡（速度140-150）30分钟，过滤，将滤液装入小白瓶中，拧紧盖，冷冻-20度冰箱保存。 熏蒸组：称取土壤鲜样25克于100毫升小烧杯，氯仿熏蒸24小时，取出烧杯，将土移入250毫升三角瓶，然后加入0.5M硫酸钾（87.1克溶于1升去离子水）80毫升，封口膜封住瓶口，摇床震荡（速度140-150）30分钟，过滤，将滤液装入小白瓶中，拧紧盖，冷冻-20度冰箱保存。 计算： 等于熏蒸与未熏蒸之差除以0.38（农化分析书上的值） 过氧化氢酶 一.实验药品配制 1.0.3%过氧化氢：将30ml的过氧化氢加蒸馏水稀释到一升，此试剂不稳定，需临时配制。 2.3N硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，再用蒸馏水稀释到100ml。 3.0.1N高锰酸钾：称取化学纯高锰酸钾3.161克溶于水并稀释至1升。贮于棕色瓶中保存备用。 4.0.1N草酸钠：称取6.7克草酸钠溶于水并稀释至1升。 二.实验步骤 1.往250ml锥形瓶中放过1mm筛的风干土样2克。 2.注入40ml蒸馏水和5ml10.3%过氧化氢。 3.将三角瓶置于震荡机上，震荡20分钟。 4.加入5ml 3N硫酸，使未分解的过氧化氢稳定。 5.将瓶中物用致密滤纸过滤。 6.取25ml滤液于100ml三角瓶中，用0.1N高锰酸钾滴定至浅粉红色，30秒不褪色即达终点，记录消耗高锰酸钾的毫升数V1。 7.对照实验：不加土样，其他步骤与样品同。记录消耗高锰酸钾的毫升数V2 三.高锰酸钾的标定 （1）取10ml0.1N草酸钠标准液于200ml三角瓶中。 （2）加蒸馏水至80ml左右，投入几粒玻璃球。 （3）加5ml 1∶3硫酸酸化。 （4）在电炉上煮沸2分钟，取下稍冷。 （5）70—80℃用高锰酸钾滴定。 四.结果计算 按下式计算过氧化氢酶活性。 M=（V2—V1）T/g 式中：M：过氧化氢酶活性。 V2：对照实验所消耗的高锰酸钾的毫升数。 V1：样品实验所消耗的高锰酸钾的毫升数。 g：样品重量。 T: 高锰酸钾滴定度的矫正值:T=V理论/V实际 (高锰酸钾的实际消耗体积与实验要求的高锰酸钾的消耗之比) 脲酶 实验药品配制 10%尿素溶液：称取100克尿素用水溶至1000ml。 甲苯：取一定量甲苯原液备用。 柠檬酸缓冲液（PH6.7） 称取368克柠檬酸用水溶至600ml 称取295克氢氧化钾用水溶至1000ml。 将二液合并，用1N氢氧化钠（自己配置较大浓度）调至PH6.7，并用水稀释至2L。 苯酚钠溶液：A：称取62.5克苯酚，溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮。 B：称取27克氢氧化钠溶于100 ml 水中。 将二液保存在冰箱中，使用前各20 ml混合，用蒸馏水稀释至100 ml。 次氯酸钠溶液：将次氯酸钠用水稀释至活性氯的浓度为0.9%。此试剂现用现配。保存在棕色瓶中。 1N氢氧化钠溶液：称取40克氢氧化钠用水溶至1L。 硫酸铵标准液：称取0.9428克硫酸铵，用水溶至1L。 实验步骤 取2克过1mm筛的风干土样于50ml容量瓶中。 称往容量瓶中加入0.4ml甲苯，室温下放置15分钟。 加入10ml尿素溶液和10ml柠檬酸缓冲液，仔细混合，将塞塞紧。 37℃培养24小时。 培养结束后，用38℃水稀释至刻度，仔细摇荡，用致密滤纸过滤于另一三角瓶中。 吸取5ml滤液于50ml容量瓶中，加10ml蒸馏水，充分摇荡。 然后加入4ml苯酚钠，仔细混合。 加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度。 1cm液槽578nm比色。 无土对照：不加土样，其他步骤与样品同。无基质对照：以10ml水代替基质，其他步骤与样品同。 标准曲线绘制 往50ml容量瓶中分别加入0，1，2，4，6，8和9硫酸铵溶液，用水稀释至刻度10ml。 取7个50ml容量瓶，分别加入5ml上述标准液，加入4ml苯酚钠，仔细混合。 加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度。 1cm液槽578nm比色。 以标准液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线