CytomicsNewsletter2006-18细胞分析术半月快讯细胞分析术半月.docVIP

细胞分析术半月快讯 第18期 1……. 流式细胞仪对照、仪器设置及阳性判断 2…….细胞分析术必威体育精装版文献及动态摘要 欢迎浏览我们的网站： 流式细胞仪对照、仪器设置及阳性判断 Holden T. Maecker *, Joseph Trotter BD Biosciences, 2350 Qume Drive, San Jose, California 95131 关键词：阴性对照，设门，特异性，荧光补偿，仪器设置 摘要 摘要：使用流式细胞仪分析的主要目的在于区分细胞对于检测指标是阳性还是阴性，或精确计算阳性细胞与阴性细胞的比例。这就需要准确的仪器设置及良好的实验重复性，分析时运用恰当对照及分析方法。各种不同的流式细胞仪实验需要不同的阴性对照，因而也是一些争论及讨论的焦点。在本教程中，我们将对照划分为不同的种类，介绍了各种类对照的选择条件及其优点。 对照样本在流式细胞仪分析中至关重要，因为研究者需要通过它来解释分析样本。任何实验可能，或者说需要，最少包括三种对照：设置（仪器）对照，特异性（设门）对照和样本间比较对照。在一些情况下，同一个对照管可能具有一种或几种以上的功能。设置或仪器对照是指那些用于正常设置（或是检测是否正确）仪器的样本，其中包括光电倍增管电压、增益和荧光补偿的调节。特异性或设门对照是指那些用于区分特异染色与非特异性染色的样本。这些对照常用于设定线性门或图型门的位置。换言之，它们是用于决定某些指标阳性或阴性的标准。样本间对照是指那些可提供样本间相关对比条件的对照，如未染色的样本或正常人样本。在某些情况下，这些对照可作为设门对照使用，如未刺激的样本可作为定义细胞因子分泌阳性/阴性的标准。在以下章节中，我们将详细讨论这三种类型的对照。 设置对照 流式细胞仪某些技术参数，如激光器校准、激光时间延迟、灵敏度等需要周期性地校准，但可能不需要在每个实验中都包括这些对照。控制、监测这些技术参数暂不在本文的讨论范围之内，所以我们假定流式细胞仪处于良好、稳定的工作状态，并且适当的仪器质控检测在日常中定期执行。每个实验可因检测不同的标志物或使用不同的荧光素，而所需特定的设置对照。流式细胞仪的设置和优化可因不同的流式细胞仪（模拟或数字）或不同的实验而各不相同（双色或多色实验）。但是任何多色实验设置（将发生荧光渗漏）都必须包括两个要素：（1）设定仪器的增益（如光电倍增管的电压）和（2）调节荧光补偿。因为计算荧光补偿值与电压密切相关，这些步骤必须按步实施，除非流式细胞软件具有随PMT电压的改变而计算补偿之功能。 设置光电倍增管电压 PMT电压有时是通过未染色样本中的细胞进行设置的。在这个方法中，调节要检测荧光的PMT电压，使未染色的细胞落在四次方对数坐标的第一次方内。然而这个方法在一些条件下并不能提供准确结果，它并不是永远有效的。此方法特别不适于与在使用长波长荧光素情况下应用，如APC、CY7、Alexa700等。这是因为在这个波段中，未染色细胞的自发荧光强度几乎接近于零，此时的信号主要是由光电倍增管及电子噪音信号构成。如果在这些荧光通道中要通过改变电压将未染色细胞调节到一次方位置中，通常是困难且主观的，它并不与实际中细胞在此通道中信号相一致。 因此，需要谨慎调节这些通道中电压，确保各个探测器有足够的增益将细胞的弱信号放大而覆盖原来的电子噪音信号。在实验中这些探测器的电压设定可由电压基准值开始进行调节。对于弱荧光的最低灵敏度或者是检测弱表达群体的能力，可由弱荧光微球的CV值来调节。在各个荧光通道中，越是高的群体荧光强度，则其中电子噪音信号对于其CV的影响就越低。通过选择与细胞染色后弱表达荧光类似的微球，然后通过调节探测器的电压将群体调节到不同的区域，就能获得群体CV与电压之间的关系图（图1）。通过曲线我们可得知这样一个趋势，样本的CV值着增益的增高而降低，只有当电压足够高时，才能使电子噪音信号对样本信号影响最小。当未染色细胞或弱荧光群体与微球相近时，每个曲线的转折点可视为获得最佳灵敏度时所需的最低电压值。此时PMT电压可能可作为基准电压来保证仪器在检测弱阳性荧光时具有最高的灵敏度。 图1：（A）通过分析弱荧光微球来显示相应探测的特征。[SPHERO多色校准微球] 可见观察到Log PMT电压值与荧光强度之间有线性关系。标准差APC-Cy7和PE-Cy7。这些荧光素发射波长的批间差异比较大，会影响荧光渗漏的稳定性，同时它们还受抗体保存和样本染色的影响。当使用这些荧光素时，使用不同的抗体来调节补偿可能会影响荧光补偿的精确性。 有两种类型的微球可用于染色细胞的荧