植物蛋白质粗提实例.docVIP

白果蛋白质提取及SDS分析 李莹莹，吴彩娥，杨剑婷，贾韶千，徐文斌，彭方仁 材料与方法 1.1 材料与试剂 白果：品种为泰兴大佛指，购自江苏泰兴市。白果去掉外种皮后于 0～4℃贮藏。 SDS凝胶电泳所用试剂 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器与设备 TU-1800PC 紫外分光光度计 北京普析通用容器有限责任公司； DYY-6C 型电泳仪 北京六一仪器厂； 电泳自动成像仪 美国BIO-RAD生化科技有限公司； PHS-2C 型数显 pH 计 上海智光仪器仪表有限公司； GL-20G-II 型冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。 1.3 原料处理及蛋白质提取 1.3.1 原料处理 冻干处理：新鲜白果于－20℃真空冷冻干燥，研磨过筛，石油醚脱脂； 烘干处理：新鲜白果于 30℃烘箱中烘烤12h，研磨过筛，石油醚脱脂； 对照：去掉外种皮后于 0～4℃贮藏的白果。 1.3.2 白果蛋白质提取 1.3.2.1 Tris-HCl 法 参照谷瑞升等[7 ]的方法。取脱脂后 3 种样品各 1g，加入10mL的0.2mol/L Tris-HCl缓冲液 pH8.0 ，4℃浸提6h 后于 4℃、4000r/min 离心 15min，取上清液测定蛋白质含量。 1.3.2.2 盐溶法 参照黄文等[5]的方法。取脱脂后3 种样品各1g，加入10mL 的0.14mol/L NaCl 溶液，4℃浸提6h 后在4℃、4000r/min 离心 15min，取上清液测定蛋白质含量。 1.3.2.3 磷酸缓冲液提取法 取脱脂后3种样品各1g，加入10mL的0.05mol/L pH8.0磷酸缓冲液 含0.1mol/L KCl、2mmol/L EDTA ，4℃浸提 6h 后 4℃、4000r/min 离心 15min，取上清液测定蛋白质含量。 蓖麻籽蛋白质粗的分离 狄建军、袁绍辉、王云、魏永春、黄凤兰、谢寇龙 主要仪器 高速冷冻离心机， 珠海黑马医学仪器有限公司 DYY-6C型电泳仪， 北京市六一仪器厂 精密pH计， 上海精密科学仪器有限公司 电子天平， 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 SHA-B数显恒温振荡器， 常州国华电器有限公司 T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司 蓖麻籽粗蛋白提取方法的优化 从超低温冰箱中取出去壳的蓖麻籽适量，放入冷冻好的研钵中迅速研磨。充分研磨后称取8.0g放入50ml的离心管中，加入5mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.5，含100mmol/LNaCl,缓冲液A）32ml，并充分混匀，4℃放置过夜。4℃、14000r/min离心30min，小心去除沉淀和白色脂肪，取上清于另一离心管中，相同条件下重复离心一次。取7个1.5ml的离心管，将所得上清液各取1000μl，分别加入不同质量的固体硫酸铵，使各管的硫酸铵浓度依次为30％、40％、50/％、60％、70％、80％、90，4℃放置过夜。4℃/17000r/min离心30min，弃上清，取500μl缓冲液A将沉淀溶解。 罗汉果蛋白酶的分离纯化及性质研究 刘国雄 Tris Augus CM Sepharose FF Amersham Phamecia BiotechSepahcryl S-200 HR Amersham Phamecia BiotechSepahcryl S-100 HR Amersham Phamecia BiotechShim-pack DIOL-300 柱 天津市先明科技发展有限公司透析袋（ DM-22，1214KD） 华美生物工程公司 Waters 2487 双波长紫外检测仪 WatersUV2401 紫外分光光度计 Shimadzu 一、罗汉果粗酶的制备将鲜罗汉果洗净，去皮，加入 3 体积的 0.05mol/L 的 Tris-HCl（pH7）缓冲液（含 1mmol/L EDTA），用组织绞碎机粉碎，匀浆，冷冻离心（8000r/min4℃）10 分钟，取上清液得罗汉果汁。取适量罗汉果汁，边搅拌边缓慢加入固体硫酸铵到饱和度为 50%，静置 2h，冷冻离心（ 8000r/min， 4℃） 10 分钟，取沉淀，用适量的 0.05mmol/L Tris-HCl（ pH7）缓冲液（含 1mmol/L EDTA）溶解，再用上述缓冲液透析过夜至用 1%的 BaCl2 溶液检测不到沉淀为止 不时换缓冲液 2-3次 ，冷冻干燥得罗汉果粗酶。二、罗汉果蛋白酶的 CM Sepharose FF 柱层析取 4g 粗酶溶于 15mL 0.05mmol/L HAc-NaAc pH4.3 缓冲溶液中，过滤出去不溶性蛋白，上样于已用 0.05mmol/L HAc-NaAc pH4.3 缓冲溶液平衡的 CMSepharose