基因工程药学整理重点复习提纲.docVIP

第一基因工程：对操作的复杂技术，将通过在体外重组导入受体细胞内，受体细胞内复制、、表达的过程。 工程药学：基因工程技术，核、蛋白质药物的理论、和应用的一门学问。 基因工程药物的特征：第一，药物过程应当是外源核酸分子在不同寄主细胞中进行繁殖，跨越天然，来自任何一种生物的基因放置在新的生物细胞中，这种生物与原生物毫无。，基因工程药物的DNA小片段新的寄主细胞中进行扩，很少量的样品拷贝出大量的DNA分子，大量的没有任何其他DNA序列污染的，纯净的DNA分子群体，这些DNA分子群体经转录、、折叠、修饰最后成为具有生物活性的基因工程药物。 基因工程药学的主要研究内容：，基因工程技术制备体内缺乏的多肽或蛋白质，替代或补充体内对这类活性多肽或蛋白质的需求。，蛋白质的生物学活性。，研究基因工程药物的临床应用。 工程技术方法：1、的获取2、表达载体的构建3、细胞4、的筛选5、生产和纯化6、、和毒性的一系列检测。 基因克隆主要包括：1、外源基因和克隆载体，DNA分子2、DNA分子导入受体细胞，外源基因随受体细胞的分裂复制、。 ：限制性内切酶将侵入细菌体内的DNA切成小片段。 modification：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，能自身的限制性内切酶所识别切割。 平末端blunt ：限制性核内切酶在识别序列中间的同一个位置进行将DNA双链切断，末端为平末端。的平末端DNA可以任意连接，连接效率低。 sticky end：大多数的限制性核酸在两条链错开2~4核苷酸处切断，的DNA末端带有5‘或者3’的DNA，的末端黏性末端。，3‘末端切割产生的是3‘，5’切割的产生的是5‘。 site preference：限制性内切酶对的不同位点表现出偏爱切割的特性，对不同位置的一识别序列表现出不同的切割效率。现象就叫做位点偏爱。 ：条件 ：剂，M2+，DTT(二苏糖醇)，BSA（小牛血清白蛋白） 三组（0~50/L）、（50~100/L）、（100~150/L） 内切酶的反应温度一般为37℃（Taq65℃， I为50℃） 时间：一个小时或者更多，时间，减少酶的用量 的方法：螯合镁离子（10/L）、（65或80处理20）和试剂盒纯化DNA（用于耐高温的）星号活性star activity：，会降低，松弛的专一性 的星号活性方式：1、较少的甘油浓度2、反应体系内无有机溶剂3、，4、的pH 5、离子强度。 酶保护宿主的DNA不被限制酶所切割。 的共同特点：脱氧核糖核苷酸连续地加入双链DNA分子链的3’-OH；核苷酸的聚合作用，从引物上解离的情况。 聚合酶I三种不同的酶催活性： ① 5‘→3’聚合酶活性。 5‘→3’的核酸外切酶活性。 ③ 3‘→5’核酸外切酶活性。 ：聚合酶I可以被分割成两个片段①具有完全的5‘→3’核酸外切酶活性。②具有完全的5‘→3’聚合酶活性和3‘→5’核酸外切酶活性。 ：DNA聚合酶I5‘→3’的聚合酶活性和3‘→5’核酸外切酶活性。 ：1、经限制性核内切酶产生的3‘末端。2、DNA片段的末端。3、合成cDNA克隆中cDNA的第二条链。4、序列测定。5、定点突变。 聚合酶的优点： ，就会不间断的合成互补链 ’→5‘外切酶活性强，单链和双链都能水解 DNA二级结构的影响，合成酶受DNA二级结构影响。 基因组文库和cDNA的异同 ，基因组文库来源于染色体DNA，DNA文是从细胞中分离总和mRNA，然后以mRNA为模板反转录cDNA，载体，。建库的技术路线不同，基因结构不同，也不同。研究的目标是要弄清楚一种蛋白质的氨基酸序列，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推导。要研究的是控制基因表达的，在mRNA分子中不存在的某些特定序列，的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。 mRNA群体中有些mRNA的拷贝数很多，的量几乎占总mRNA的50%~90%，，高丰度mRNA。一些mRNA拷贝数很少，总mRNA的0.5%，，低丰度RNA。 聚合酶链式反应PCR：体外扩增DNA或RNA片段的技术，无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法。与分子克隆和DNA测序并称为分子生物学的三大主流技术，了分子生物学的主要实验基础。 PCR的基本原理：细胞内DNA复制，拟扩增的DNA分子为模板，与模板链分别互补的核苷酸片段引物，耐热DNA聚合酶的作用下，半保留复制的机制，延伸合成新的DNA。 PCR的步骤： 通过升温使目标DNA双螺旋的氢键断裂，作为反应模板链的单DNA。的温度由G+C含量决定，，。由模板DNA的长度决定，，。 将反应体系冷却至特定温度，引物与模板DNA的互补区结合，模板-复合物。温度过高，引物和模板DNA不能很好地结合，扩增效率下降。，引物DNA结合，非特异性DNA片段。温度通过预实验来确定，引物