蛋白质的改造详解.pptVIP

OmpA是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白之一, 由325个氨基酸残基组成，通过β折叠跨膜8次,形成4个朝向膜外的loop,在L2、L3、L4中插入外源基因都能获得表面表达； IgA蛋白酶是致病性革兰氏阴性菌淋病奈瑟球菌的一种分泌性酶,其分泌机制需要C末端的参与，N端含有特异性的信号肽辅助其穿越内膜,C末端能整合在细菌外膜上,中间部分为IgA蛋白酶的功能区，将外源基因取代该区域可实现表面呈现； LamB是革兰氏阴性菌外膜蛋白Porin家族成员，其三维结构显示Loop9(第375-405位氨基酸)是暴露的最大的环，适于外源蛋白插入。 革兰氏阳性菌表面展示系统 葡萄球菌蛋白A（SpA）由信号肽、IgG结合区和C末端的表面结合区组成。葡萄球菌表面呈现系统是利用SpA的C末端锚定区,用外源蛋白取代IgG结合区片段，基因以质粒形式存在于宿主细胞内，融合蛋白表达并呈现在细菌表面。 Pro- and eukaryotic surface display systems 细菌细胞表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)或流式细胞筛选仪(Flow cytometry)是非常有效的高通量筛选方法。此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。这种技术是当前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。由于在基因和它编码的蛋白质以及目的功能之间建立了一个直接连接，大容量蛋白质突变体库的筛选被大大简化。流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有明显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。 流式细胞术利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪集激光技术、电子物理技术、光电测量技术计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列(又叫定位序列)融合后导入宿主细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面。与噬菌体和细菌细胞表面展示技术相比，酵母细胞表面展示表达系统具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠和与哺乳动物类似的分泌机制的优势。 酵母表面展示 将蛋白分子编码序列与α-凝集素Ｃ端(３２０个氨基酸残基，含有锚定信号序列)编码序列连接后插入载体信号肽下游分泌表达，信号肽引导嵌合分子向细胞外分泌，而凝集素则锚定在酵母细胞壁中，从而将酶分子展示表达。 a-凝集素由两对二硫键连接的Ａga1基因编码的核心亚基(７２５个氨基酸残基)和Ａga2基因编码的小结合亚基(６９个氨基酸残基)组成。目的蛋白与结合亚基ＡGA2的C末端融合。ＡGA2融合蛋白和ＡGA1在分泌途径中结合，并被转运到细胞表面后与细胞壁共价结合。 酵母展示系统应该满足以下几个条件：首先，表达偏差应该是最小的，以便DNA库的多样性可代表正确折叠蛋白质的多样性；其次，要有定量筛选的标准；最后，被选系统必须能很好的区分仅有微弱亲和力差别的突变体。 酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋白质。与噬菌体不同，酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体分离成为可能。由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽提，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景。 三、蛋白质分子定向进化的应用 提高酶分子的催化活力 提高酶分子稳定性 提高酶分子对环境的适应能力 提高酶分子的对映体选择性 变换催化反应专一性 理性：针对性、目的性、特异性 非/半理性：随机性，筛选，定向进化 化学修饰，定点突变，拼接，合成 * 突变库经历了DNA 片段的重新组装, 与高错误倾向PCR 有本质的不同。该方法由多个亲本参与进化, 引入了重组、缺失、重复等多种突变类型, 并且可以迅速积累有益突变。 用随机引物在DNA 模板上扩增DNA 片段, 再用类似有性PCR 的方法组装成全长基因 。该方法对模板DNA 需求量小, 并可对较短的DNA 分子进行优化, 在扩增DNA 片段时可同时引入错配碱基, 产生点突变, 获取比有性PCR 更广泛的突变库。 As shown in Figure 1, random sequence primers are used to generate a large number of short DNA fragments complementary to different se