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蛋白质的分离纯化与鉴定Isolation, Purification and Identification of Protein 杨学习 世界生命科学的圣地与分子生物学的摇篮 --冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory） 分子生物学圣经—分子克隆实验指南 蛋白质工程中进行蛋白质分离纯化的必要性 化学修饰法对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料 为了研究蛋白质工程的效果，需要单一的蛋白质作为实验材料研究其结构与功能 为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品 目录 前言 蛋白质纯化方法 蛋白质纯化总原则及步骤 总原则 蛋白质纯化的步骤 材料的选择与预处理 蛋白质的提取 蛋白质的粗分级 蛋白质的细分级 蛋白质的鉴定 蛋白质纯化的原则 蛋白质的鉴定 一、蛋白纯化方法 能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因是不同蛋白质在许多理化性质上有着极大的不同。 这些理化性质的不同是由于氨基酸的数目和序列不同造成的。 1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性 分子大小 分子形状 带电特性 溶解特性 与配体特异性结合不同 吸附性质 变性和复性 1.1分子大小 大小 蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。 几百—百万 Da 常用方法 透析 超滤 凝胶过滤 离心 凝胶过滤 超速离心 1.2分子形状 形状 形状的不同会导致蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到它的形状的影响。 方法 梯度离心的影响 电泳的影响 1.3电荷 原理 蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。若天冬氨酸和谷氨酸占优势，在pH 7.0时带净负电荷，称为酸性蛋白质。若赖氨酸和精氨酸占优势，在pH 7.0时带净正电荷，称为碱性蛋白质。 方法 电泳 离子交换层析 1.4溶解度 原理 由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。 方法： 通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析 盐析原理： 高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水，破坏蛋白质分子表面的水膜，同时盐离子也会影响蛋白质分子所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。 硫酸铵分级沉淀 有机溶剂分级沉淀 等电点沉淀法 1.5配体特异性结合 原理 生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合，这种结合是特异的又是可逆的，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。 方法 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。 分类 免疫亲和层析 生物亲和层析 金属螯合亲和层析 拟生物亲和层析 1.6吸附性质 原理 方法 羟基磷灰石层析 疏水层析 1.7变性和复性 原理 蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。 方法 尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白 2. 分离方法 沉淀法 离心法 电泳法 超滤法 相分配法 层析法 二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤 总原则 以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。 步骤 选择实验材料，实验材料预处理 蛋白质的提取 蛋白质的粗分级 蛋白质的细分级 蛋白质的鉴定 蛋白质纯化的前期准备 什么是最好的来源： 蛋白质需要有多纯： 纯化蛋白的量要多少： 蛋白质应该如何进行鉴定： 纯化时间应该多长: 什么是最终花费： 如何纯化蛋白质： 关于蛋白质我们已知什么： 1、选择实验材料及预处理 选择实验材料 物种的选择 组织的选择 实验材料预处理 液体材料 过滤 离心 固体材料 洗涤：自来水—蒸馏水—提取缓冲液 材料破碎： 材料破碎 机械剪碎 研磨 反复冻融法 超声破碎法 高压匀浆法 酶解法 2、蛋白质的提取 1.提取分离原则 尽可能多地提取目的蛋白，同时避免因热、 pH或有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素造成活性丢失。 选择合适的pH、选择合适的离子强度 选择合适的比例 2、蛋白质的提取 2.提取液成分的确定 pH 缓冲液：Tris-Hcl, Tris-Gly, Gly-Hcl, 柠檬酸-柠檬酸钠 离子强度：动物 NaCl, 植物KCl 还原剂:DTT, 2-巯基乙醇 蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF, TPCK,TLCK 金属离子螯合剂: EDTA, EGTA 去污剂:SDS, CHAPS, Trito